1. Общие сведения

1.1 Окраска спор. Все методы окраски спор основаны на обеспечении проникновения красителя через трудноокрашиваемую оболочку споры. Поэтому применяют протраву.

Окраска спор по Златогорову. На фиксированный мазок наносят:

1) Карболовый фуксин, окрашивают 5-10 мин.

2) 2% раствор серной кислоты, выдерживают 2-3 сек.

3) Раствор метиленовой сини, окрашивают 3-5 мин.

Микроскопическая картина: споры красного цвета, вегетативные формы – синие.

1.2 Окраска капсул. Тело микробной клетки покрыто рыхлым слизистым слоем. У некоторых видов микроорганизмов этот слой развивается очень сильно и тогда он называется капсулой.

Капсула – слизистый слой оболочки, муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид, который синтезируется в цитоплазме и секретируется на поверхности клеточной стенки (является производным наружного слоя оболочки).

Наличие капсулы является важным диагностическим признаком при идентификации и дифференциации возбудителей некоторых инфекций (сибирской язвы, пневмококковой пневмонии и др.) Патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме. Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки крови. Размеры их чаще превышают тело микробной клетки. Химический состав капсул неоднородный: одни из них состоят из комплекса белков, другие – из полисахаридов. Капсула и остальная часть клетки окрашиваются неодинаково: первая как бы выполняет роль защиты и часто встречается у патогенных микроорганизмов.

Существует несколько методов окрашивания капсул.

Капсульное вещество плохо окрашивается. Поэтому при приготовлении препарата для обнаружения капсулы выполняют следующие правила:

1. Мазок готовят из свежего материала, так как капсула быстро лизируется.

2. Фиксируют мазок химическим способом, для окраски применяют метахромотические краски, то есть при использовании, которых цитоплазма окрашивается в один цвет, а капсула - в другой;

3. Промывать мазок водой следует слабо и кратковременно

Окраска капсул по Михину. На фиксированный мазок наносят:

1. Метиленовый голубой Леффлера (лучше старым раствором), окрашивают 2-3 мин. при подогревании.

2. Смывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: тела микробных клеток темно-синего цвета, капсулы – светло-розового.

Окраска капсул по Ольту. На фиксированный мазок наносят:

1. Свежий горячий 2%-ный раствор сафранина, окрашивают 5-7 минут.

2. Быстро промыть водой и высушивают.

Микроскопическая картина: тело клетки окрашивается в красно-кирпичный цвет, капсула – в желто-оранжевый.

1.3 Определение подвижности микроорганизмов

У подвижных видов органами передвижения являются жгутики, которые осуществляют вращательные движения. Расположение их на теле микробной клетки различное. Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0,2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии. В зависимости от расположения и количества жгутиков микроорганизмы подразделяют (рисунок 5) на:

а) монотрихи - микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик. Это самые подвижные бактерии, движения активные, поступательные (псеудомонас);

б) лофотрихи - микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков, движения активные, поступательные (листерии);

в) амфитрихи - микроорганизмы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки, передвигаются беспорядочно;

г) перитрихи - микроорганизмы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки, передвигаются беспорядочно (кишечная палочка).

Рисунок 5 Типы расположения жгутиков у бактерий

Для определения подвижности у бактерий необходимо использовать культуру не старше суточного возраста, так как старые культуры утрачивают способность передвигаться. Исследование проводят путем приготовления висячей или раздавленной капли.

Метод «висячая капля». Висячую каплю готовят на предметном стекле с углублением (луночкой). Край луночки смазывают тонким слоем вазелина и наносят на покровное стекло микроорганизмы. Если они выращены в жидкой среде, берут каплю такой культуры, если на плотной, то сначала на покровное стекло наносят каплю изотонического раствора натрия хлорида, а затем культуру микробов. Предметное стекло проворачивают на 180° и аккуратно опускают на покровное так, чтобы капля оказалась в центре углубления, после чего его возвращают в прежнее положение. В таком препарате капля подвешена с внутренней поверхности покровного стекла и находится в герметически закрытой влажной камере Это позволяет наблюдать за движением микробов в течение длительного времени. Препарат рассматривают в слегка затемненном поле (диафрагму сужают), что увеличивает контрастность неокрашенных форм.

Метод «раздавленная капля». Каплю бактериальной взвеси наносят на обычное предметное стекло, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают пальцем. Микроскопию проводят, так же как и в методе «висячая капля».

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5

Методы стерилизации. Лабораторная аппаратура.

Цель занятия. Изучить физические, химические и биологические методы стерилизации. Ознакомиться с лабораторной аппаратурой для стерилизации и культивирования микроорганизмов (термостат).

Оборудование и материалы. Стерилизаторы: простые металлические, аппарат Коха, автоклав, спиртовка. Сушильный шкаф, термостат. Инструменты и посуда для стерилизации.