1. Общие сведения

При сложных методах окрашивания применяют несколько растворов красителей и реактивов. Они основаны на физико-химических различиях состава микробных клеток. Эти методы позволяют помимо морфологии бактерий, определить их тинкториальные особенности (различное окрашивание при использовании специальных методов) и наличие или отсутствие структурных элементов клетки (капсула, спора), что имеет важное дифференциально-диагностическое значение. Химический состав и строение клеточной стенки микробов различны, поэтому они окрашиваются одними и теми же красителями по-разному и неодинаково отдают их при последующем обесцвечивании этиловым спиртом, кислотами и другими реактивами. Части микробной клетки избирательно реагируют на красящие растворы. На этом свойстве основаны сложные (дифференциальные) методы окрашивания микробов. Для сложного окрашивания используют несколько красителей. В лабораторной практике применяют методы Грама, Циля–Нильсена, Козловского и др.

Окраска по Граму. Метод Грама (модификация по Синеву). Этот метод позволяет все микроорганизмы разделить на две группы: грамположительные (Гр+) и грамотрицательные (Гр–).

На фиксированный мазок наносят:

1) Кусочек фильтровальной бумаги пропитанной 1%-ым спиртовым раствором генцианвиолета. Наносят на бумажку 2-3 капли воды и окрашивают 2-3 минуты. Бумажку снимают, не промывают.

2) Наносят раствор Люголя на 2 минуты, смывают.

3) Обрабатывают 96%-ным этиловым спиртом в течение 20-30 секунд и тщательно промывают мазок водой.

4) Окрашивают мазок фуксином в течение 2-3 минут и промывают водой.

5) Высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина: грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в розовый.

Окраска микроорганизмов по этому методу зависит от химического состава клеточной стенки (наличие муреина и частично липида), цитоплазмы и pH среды.

Окраска по Цилю-Нильсену. На фиксированный мазок наносят:

Небольшой кусок фильтровальной бумаги, на него наносят раствор карболового фуксина, снизу препарат подогревают над пламенем горелки до появления паров и оставляют на «мостике» 5-7 минут. Затем краску с бумажкой сливают (не промывая). Наносят 3-5% раствор серной кислоты, окрашивают 5-7 минут, хорошо промывают водой. Затем добавляют раствор метиленовой сини (по Леффлеру), окрашивают 4-5 минут. Препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: кислото-спиртоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет (не обесцвечиваются кислотой), некислотоустойчивые – в синий (окрасившись первоначально фуксином в красный цвет, легко обесцвечиваются кислотой и воспринимают дополнительную окраску метиленовой сини)

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4

Окраска спорообразующих и капсулообразующих микроорганизмов. Определение подвижности бактерий.

Цель занятия. Освоить основные способы окрашивания спор. Изучить виды микробов в зависимости от расположения жгутиков. Определить подвижность микроорганизмов.

Материалы и оборудование. Культуры сенной бациллы, предметные стекла, предметные стекла с луночкой, покровные стекла, микроскопы, колодки с красками, иммерсионное масло, тампоны ватные спиртовые.