Хід роботи
1. Приготування плівок-підкладок із формвару. Для приготування плівок використовують 0,1–0,2%-й розчин формвару (полівінілформальдегіду). Розчинниками можуть бути діоксан, дихлоретан та ін.
Чисте предметне скло швидко занурюють у розчин формвару, через 5–10 с витягують і підсушують (рис. 3, а). Сушать скло 40–60 с до зникнення запаху розчинника. Плівку, що утворилася на склі, можна виявити, якщо подихати на нього. Цю плівку підрізають лезом бритви, потім знімають на воду– скло повільно занурюють у воду під кутом 450 (рис. 3 б, в). На плівку викладають сітки і знімають їх за допомогою фільтрувального паперу.
Для цього півколо фільтрувального паперу тримають над плівкою формвару із сіточками і повільно кладуть на поверхню, доки воно не вбере воду. Потім занурюють папір у воду, перевертають його і виймають із води разом із плівкою і сіточками, які знаходяться між фільтрувальним папером і плівкою формвару.
Рис 3. Приготування плівок-підкладок із формвару:
1– предметне скельце; 2– розчин формвару
Сітки з плівкою висушують та зберігають в чашках Петрі.
2. Приготування препарату методом негативного контрастування. На сіточку з плівкою-підкладкою наносять краплину суспензії вірусних часток. Через 30–60 с рідину відбирають фільтрувальним папером, сіточку висушують. На сіточку наносять краплину контрастувальної речовини і через 1 хв відбирають рідину. Після просушування препарат готовий для дослідження в електронному мікроскопі.
Контрольні запитання
Яка схема будови електронного мікроскопу?
Як приготувати плівку-підкладку із формвару?
У чому полягає суть методу негативного контрастування вірусних часток?
Чим обумовлена необхідність контрастування вірусних часток для дослідження в електронному мікроскопі?
Які речовини використовуються у методі негативного контрастування?
Лабораторна робота 7 Визначення питомої інфекційності препаратів нативного втм, рнк втм і вірусоподібних агрегатів, отриманих реконструкцією in vitro
Мета: порівняти питому інфекційність препаратів нативного ВТМ, РНК ВТМ і вірусоподібних агрегатів, отриманих реконструкцією in vitro.
Матеріали та обладнання: розчин вірусної РНК з концентрацією 5 та 10 мкг/мл, суспензія вірусу, отриманого реконструкцією з концентрацією РНК 5 та 10 мкг/мл, суспензія нативного ВТМ з концентрацією РНК 5 та 10 мкг/мл, 0,05 М фосфатний буфер, рН 7,5 (для розведень), свіжі зрізані листки індикаторної рослини Nicotiana glutinosa, абразив карборунд, скляні палички, камери для підтримки постійних умов температури та вологості, цупкий картон, фільтрувальний папір.
Теоретичні відомості
Питома інфекційність (інфекційність, віднесена до одиниці ваги інфекційного агента) – одна із стандартних біологічних характеристик вірусного препарату та препаратів інфекційної вірусної РНК.
Для розрахунку питомої інфекційності зазвичай готують декілька розведень інфекційного агента (наприклад, 5 та 10 мкг/мл РНК), ними заражують по 10 половинок листків індикаторної рослини та визначають відношення середньої кількості некрозів, спричинених інфекційним агентом до концентрації РНК. Об’єм інокулюма, що використовується для інфікування повинен бути постійним і залежити від розміру листків рослини. Слід зазначити, що об’єм віруса, взятого для інокуляції, зазвичай не враховують для розрахунку питомої інфекційності. Для оцінки питомої інфекційності нативного вірусу розрахунки зазвичай проводять на 1 мкг вірусного нуклеопротеїду. Проте при порівнянні інфекційності препаратів РНК з нативним вірусом необхідно розрахувати питому інфекційність на 1 мкг віріонної РНК.
Питома інфекційність – умовна величина, яка залежить від ряду факторів (умов зараження, властивостей інфікуємих об’єктів, якості виділених препаратів).