Контрольні запитання
У чому суть процесу реконструкції віріонів?
Коли і ким було відкрите явище реконструкції віріонів in vitro?
Яка роль належить парним дискам ВТМ у процесі збірки віріону?
Які типи зв’язків є основними між білковими молекулами і нуклеїновою кислотою при самозбірці вірусів в умовах in vitro?
Чому важливо підтримувати рН розчину на рівні 7,0-7,5 під час реконструкції вірусних часток?
Лабораторна робота 6 Електронна мікроскопія
Мета: оцінити ефективність проведеної реполімеризації вірусного білку та визначити форму реконструйованих вірусних часток за допомогою методу електронної мікроскопії.
Матеріали та обладнання: електронний мікроскоп «ПЕМ-100», предметні знежирені стекла, 0,2%-й розчин формвару в дихлоретані, мідні сітки, пастерівські піпетки, гумові груші, леза бритви, 2%-й розчин фосфорновольфрамової кислоти (ФВК), фільтрувальний папір, чашки Петрі, стаканчики, дезінфекційний розчин.
Теоретичні відомості
Для оцінки ефективності проведеної реполімеризації вірусного білку та визначення форми реконструйованих вірусних часток використовують метод електронної мікроскопії.
Принципова схема будови електронного мікроскопа. Електронний мікроскоп має вигляд металічного циліндра (колона мікроскопа), у якому розміщені електронна гармата й система електромагнітних лінз (рис 2).
Рис. 2 Схема електронного мікроскопу трансмісійного типу. Магнітні лінзи умовно позначені як скляні:
а – мікроскоп з однією конденсорною лінзою та двоступеневим (за допомогою об’єктивної та проекційної лінз) збільшенням; б – мікроскоп з подвійною конденсорною лінзою та трьохступеневим збільшенням
Усередині колони створюють вакуум 10-4 – 5×10-5 мм рт.ст. Пучок електронів, сфокусований конденсорною лінзою, проходить через досліджуваний об’єкт і начебто «просвічує» останній, взаємодіючи з атомами його речовини. При цьому електрони змінюють свої траєкторії – розсіюються і потрапляють у магнітне поле об’єктивної лінзи. Різні ділянки об’єкта залежно від їх густини, а також плівка-підкладка, на якій знаходиться об’єкт, розсіюють електрони неоднаково. Чим щільніші ділянки, тим вища їх розсіювальна здатність, отже, тим темніше буде їх зображення на екрані. Об’єктивна лінза, найважливіша частина електронного мікроскопа, формує перше збільшене зображення об’єкта. Деякі моделі електронних мікроскопів мають проміжну лінзу, розміщену нижче за об’єктивну. Вона призначена для одержання другого збільшеного зображення об’єкта. Проекційна лінза створює остаточне збільшення зображення об’єкта, видиме на флюоресціюючому екрані електронного мікроскопа.
Дослідження реполімерів вірусного білку та реконструйованих вірусних часток в електронному мікроскопі за допомогою методу негативного контрастування. Досліджувані об’єкти розміщують на тонесеньких плівках-підкладках, опорою для яких слугують спеціальні сітки, виготовлені з міді електролітичним способом або сплетені з тонкого дроту. Ті ж електрони, які формують зображення досліджуваних об’єктів, взаємодіють із плівкою-підкладкою. Тому, якщо товщина плівки відносно велика або матеріал, з якого вона зроблена, сильно розсіює електрони, контрастність зображення розміщеного об’єкта різко погіршується. Матеріал плівки повинен бути міцний, мати значну теплопровідність та стійкість до бомбардування електронами.
Сутність методу негативного контрастування полягає в тому, що досліджуваний об’єкт занурюють у речовину високої електронної щільності, у результаті чого контрастуюча речовина обволікає вірусні частинки, проникає в їх гідрофільні ділянки, заміщуючи воду. Малоконтрастний зразок стає більш чітким порівняно з оточуючим темним фоном. Найчастіше для цього використовують 1–2%-й розчин фосфорновольфрамової кислоти (рН 7–7,4), який доводять за допомогою 1н розчину їдкого калію або 0,5–2%-й розчин уранілацетату. Барвник може змішуватися з розчином об’єкта або до нанесення на підкладку, або наноситися на підкладку після адгезії на неї об’єкта. За звичайної процедури негативного контрастування концентрація вірусних часток повинна бути приблизно 10-6–10-7 на 1 мл. У процесі підбору оптимальної концентрації важливо, щоб не було накладання часток одна на одну. Роздільна здатність негативного контрастування вища, ніж методу відтінення, і досягає 12 Å.