Лабораторна робота 5 Реконструкція часток втм із рнк і білку in vitro вірусоподібних агрегатів

Мета: провести реконструкцію інфекційного ВТМ із вільної РНК і низькомолекулярного вірусного білку.

Матеріали та обладнання: Розчин структурного білку (4 S-білок) ВТМ з концентрацією 1,0 мг/мл у 0,01 М фосфатному буфері, рН 8,5, розчин РНК ВТМ (10,0 мкг/мл) в 0,1 М фосфатному буфері, рН 7,0, 1 М фосфатний буфер, рН 7,0, 0,01 М К-Na фосфатний буфер, рН 7,25, ультрацентрифуга, рефріжераторна центрифуга ЦЛР-1, спектрофотометр, термостат.

Теоретичні відомості

Явище реконструкції, тобто збірки повноцінних часток ВТМ з препаратів інфекційної РНК і низькомолекулярного структурного білку оболонки, було описано Х. Френкель-Конратом у кінці 50-х років ХХ ст. Це відкриття було одним із перших значних успіхів молекулярної біології вірусів, так як було доведено, що структура вірусного нуклеопротеїда повністю визначається структурою його компонентів, які можуть бути включені у процес самозбірки in vitro.

Самосбірка вірусів з білків та нуклеїнової кислоти проходить на рівні четвертичних структур, і на перших етапах в процесі агрегації включаються електростатичні сили, які впливають на орієнтацію молекули. Після цього в процес агрегації підключаються водневі, вандервальсові зв’язки та гідрофобні взаємодії. Тільки після гранично близького зближення атамів настає агрегація та формування структур.

Інтенсивне дослідження різних аспектів явища реконструкції вірусних часток продовжується й досі. Як виявилося, що при оптимальних умовах реконструкція ВТМ може здійснюватися із високою ефективністю (в окремих дослідах білковою оболонкою «вдягається» до 80-100% внесених молекул РНК). Для отримання біологічно активного (інфекційного) реконструйованого вірусу необхідно використовувати інтактні молекули РНК і нативний білок ВТМ. Реконструкція ВТМ здійснюється не за рахунок зв’язування одиничних субодиниць вірусного білку з вірусною часткою, що формується, а шляхом приєднання крупних білкових блоків, так званих парних дисків (20 S агрегатів білку). Парний диск складається з 34 субодиниць білку, укладених у 2 кільцевих шари, по 17 субодиниць у кожному шарі. Білок ВТМ спонтанно агрегує в парні диски за рН 7,0-7,5 та помірній іонній силі розчину. Виділений білок деяких штамів ВТМ може утворювати агрегати не тільки з геномом свого вірусу, а також з нуклеїновою кислотою інших вірусів (жовтої мозаїки турнепсу, деяких РНК-геномних бактеріофагів, бромовірусу та ін.).

До теперішнього часу можливість реконструкції in vitro продемонстровано для цілого ряду вірусів (Х-вірусу картоплі, вірусу мозаїки папаї, вірус штриховатої мозаїки ячменю).

Модифіковані та «змішано» реконструйовані спіральні віруси рослин можуть слугувати контейнерами для зберігання і доставки у клітини людини та тварин «терапевтичних генів» та лікарських препаратів.

Хід роботи

Для проведення реконструкції до 1 мл розчину 4 S-білку (1 мг/мл) додають 1 М фосфатний буфер (рН 7,0) до 0,1 М і суміш витримують 18 год при кімнатній температурі (для утворення парних дисків). Потім до препарату додають 5 мл розчину РНК (10 мкг/мл) і суміш поміщають до термостату з температурою 24⁰С на 6 год. У процесі інкубації відбувається утворення вірусних часток, що супроводжується збільшенням опалесценції.

Через 6 год вміст пробірки центрифугують 10 хв при 18 тис. об/хв для видалення неспецифічних білкових агрегатів і надосадову рідину, що містить реконструйований вірус, ультрацентрифугують в режимі, який забезпечує осадження інтактного ВТМ (90 хв, 30 тис. об/хв). Осад вірусу ресуспендують у 2-3 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,25 і центрифугують 15 хв при 18 тис. об/хв для видалення агрегованого матеріалу. Отримані препарати реконструйованого вірусу аналізують в електронному мікроскопі, визначають їх інфекційність і спектри дійсного поглинання. За всіма цими параметрами реконструйований вірус має відповідати ВТМ, отриманому з інфікованих рослин. Вихід реконструйованого вірусу розраховують як відношення кількості РНК, що уввійшла до складу віріонів, до кількості РНК, внесеної до реакційної суміші (у нашому випадку – 50,0 мкг).