Контрольні запитання

1. У чому суть процесу реполімеризації структурних білків вірусів?

2. За яких умов утворюються різні асоціативні форми структурного білку ВТМ?

3. Яким чином проводять виділення структурного білку ВТМ?

4. Для чого використовують діаліз ?

5. Яким чином визначають якість отриманого препарату реполімеризованого білку?

Лабораторна робота 4

Виділення рибонуклеїнової кислоти (РНК) ВТМ за допомогою додецилсульфата натрію (ДСН) і перхлорату

Мета: виділити РНК ВТМ за допомогою ДСН і перхлорату.

Матеріали та обладнання: Водний 25% розчин ДСН, 100% розчин NaClO₄, 3 М ацетатний буфер, рН 5,0, 96% етанол, 10 М LiCl, 0,1 М фосфатний буфер, рН 7,0, суспензія ВТМ (10,0-50,0 мг/мл), рефріжераторна центрифуга ЦЛР-1, прозорі центрифужні пробірки.

Теоретичні відомості

Для виділення препаратів вірусних РНК або ДНК найчастіше використовується метод фенольної депротеїнізації. Проте цей метод потребує спеціальних заходів для пригнічення активності рибонуклеаз, домішки яких можуть виявлятися навіть у високоочищених препаратах вірусів. Вихід РНК ВТМ за фенольної екстракції складає зазвичай не більше 50-60 % від розрахованого.

На відміну від методу фенольної депротеїнізації, виділення РНК за допомогою ДСН і перхлорату характеризується простотою, високою швидкістю і ефективністю. Перхлоратний метод використовується для виділення РНК із ВТМ та інших рослинних вірусів. Процес виділення РНК ВТМ за цим методом займає 1-2 год, вихід РНК складає 70-80% і отримана РНК характеризується високим ступенем нативності.

Хід роботи

До суспензії ВТМ додають розчин ДСН до кінцевої концентрації 5% (ДСН у такій концентрації активно інактивує РНК-ази). Суміш вносять у прозору центрифужну пробірку і прогрівають 3 хв при 70⁰С (при цьому зникає характерна для ВТМ опалесценція), додають 3 об’єма 100% NaClO₄ (до кінцевої концентрації 75%) і центрифугують 10 хв при 3 тис. об/хв при +2⁰С. Білок у комплексі із ДСН флотує і утворює зверху центрифужної пробірки міцний білковий шар. За допомогою шприца, що вводиться у пробірку через верхній білковий шар), збирають у стакан нижній водний шар, що містить РНК. До розчину РНК додають 3 М ацетатний буфер (рН 5,0) із розрахунку 1 краплина на 1 мл розчину (для кращого осадження РНК) і додають 2 об’єма охолодженого до −20⁰С етанолу. Суміш перемішують та витримують у холодильнику при −20⁰С 1-2 години. Осад РНК збирають центрифугуванням на холоді (6 тис. об/хв, 20 хв), додають ¼ об’єму 10 М LiCl і залишають на холоді при −20⁰С на декілька годин. При цьому осаджується лише високомолекулярна РНК. Осад РНК розчиняють в 0,1 М фосфатному буфері, рН 7,2. Отриманий препарат РНК можна зберігати протягом декількох діб у холодильнику при −20⁰С.

Контрольні запитання

1. Яку дію спричинює ДСН на РНК-ази?

2. Які методи застосовуються для виділення нуклеїнових кислот вірусів?

3. З якою метою використовують охолоджений етанол?

4. Яку речовину використовують для осадження високомолекулярної РНК?

5. З чим пов’язаний невисокий вихід РНК при застосуванні методу фенольної депротеїнізації?