Контрольні запитання

1. З якою метою проводять вимірювання спектрів поглинання ультрафіолетового випромінювання очищених вірусних препаратів?

2. Про що свідчить зменьшення співвідношення Е₂₆₀/Е₂₈₀ у виділеному препараті порівняно із стандартною відомою величиною для чистого вірусу?

3. Чому при визначенні спектрів поглинання вірусних препаратів враховують поправку на світлорозсіювання?

4. В чому полягає метод екстраполяції при визначенні дійсних спектрів поглинання?

5. Яку величину використовують для характеристики світлорозсіювання вірусних суспензій і як її застосовують для оцінки якості вірусних препаратів?

Лабораторна робота 3 Реполімеризація білку втм in vitro з утворенням вірусоподібних агрегатів

Мета: виділити структурний білок ВТМ ацетатним методом та провести його реполімеризацію in vitro.

Матеріали та обладнання: Суспензія ВТМ (10-50 мг/мл), охолоджена концентрована оцтова кислота, дистильована вода (охолоджена до +4^○С), 1 М ацетатний буфер, рН 4,7, 0,01 М фосфатний буфер, рН 8,5, 0,1 М NaH₂PO₄ (рН 4,6), центрифуга ЦЛР-1, крижана баня, целофан для діалізного мішечка, ємність для діалізу об’ємом 3 л, холодильник, ультрацентрифуга, магнітна мішалка.

Теоретичні відомості

За певних умов вірусна частка ВТМ може дисоціювати на білок і РНК. Так, обробка вірусу 66 % розчином оцтової кислоти спричинює дисоціацію рибонуклеопротеїду на білок (у розчині) та РНК, що утворює в цих умовах преципітат. Як було показано, реполімеризація очищеного низькомолекулярного білку ВТМ може відбуватися у відсутність РНК. Цей процес проходить з утворенням ряду проміжних білкових агрегатів з поступово збільшеними розмірами і закінчується утворенням спіральних вірусоподібних часток, необмежених за довжиною із-за відсутності РНК.

Очищений білок ВТМ в залежності від рН, іонної сили та інших параметрів може бути представлений різними асоціативними формами. Наприклад, при низьких значеннях рН або в присутності РНК утворюються спіральні структури, при нейтральних і більш високих рН – структури з дисків. Тому для отримання спіральних вірусоподібних агрегатів очищений білок вірусу витримують при рН 5,5.

Реполімери вірусних білків застосовують у нанобіотехнології як матриці для створення різних біоорганічних полімерів (нанотрубок, наноелектродів, нанопроводників). Нові матеріали отримують при взаємодії правильно організованих білкових вірусоподібних структур з неорганічними матеріалами, наприклад наночастками або атомами золота, платини тощо.

Хід роботи

1. Виділення структурного білку ВТМ ацетатним методом. У центрифужний стакан вносять суспензію ВТМ, охолоджують до 0–+3⁰С, і за неперервного перемішування приливають 2 об’єма концентрованої оцтової кислоти. Суміш інкубують 30 хв в крижаній бані, перемішуючи. При цьому відбувається руйнування вірусу і осадження РНК. Пластівцеподібний осад РНК відділяють центрифугуванням (10 тис. об/хв, 15 хв, +2⁰С), прозорий розчин білку розводять рівним об’ємом холодної дистильованої води і переносять в мішечок для діалізу. Розчин протягом декількох діб діалізують проти 3-4 змін дистильованої води (по 3 л) на холоді (+2–+4⁰С) при перемішуванні на магнітній мішалці.

У ході діалізу рН розчину в діалізному мішечку досягає ізоелектичної точки білку ВТМ (рН 4,7) і білок випадає в осад, внаслідок чого рідина в діалізному мішку стає каламутною. Осад білку збирають центрифугуванням (18 тис. об/хв, 15 хв, +2⁰С) і розчинюють у 0,01М фосфатному буфері (рН 8,5). Для видалення можливих домішок недеградованого вірусу і денатурованого білку розчин ультрафентрифугують (30 тис. об/хв, 90 хв). Прозорий розчин білку зберігають на холоді при +2⁰С. Коефіцієнт поглинання білку ВТМ (Е^1%_{280, 1 см}) складає 13,0 оптичних одиниць. Спектр поглинання білку характеризується наявністю максимуму при 280 нм і мінімуму при 245-250 нм. Співвідношення Е₂₆₀/Е₂₈₀ для білку ВТМ складає 1,6-1,7.

2. Реполімеризація білку ВТМ in vitro. Розчин 4 S-білку ВТМ (низькомолекулярний структурний білок ВТМ) вносять у пробірку, підкислюють на холоді 0,1 М NaH₂PO₄ (рН 5,5) і залишають при кімнатній температурі (20-25⁰С). За цих умов вірусний білок агрегує у частинки паличкоподібної форми, подібні за структурою з інтактними віріонами ВТМ. Утворення таких часток приводить до появи опалесценції. Інкубацію при кімнатній температурі продовжують протягом декількох годин і отриманий препарат реполімеризованого білку центрифугують 10 хв при 10 тис. об/хв для осадження неспецифічних білкових агрегатів.

Якість отриманого препарату реполімеризованого білку (надосадова рідина) контролюють в електронному мікроскопі і шляхом визначення спектрів дійсного поглинання. При електронній мікроскопії в препараті повинні виявлятися правильні палочкоподібні частки зі спиральним типом симетрії білкових субодиниць. Спектр дійсного поглинання (з урахуванням розсіювання світла) препаратів реполімеризованого білку має бути таким же, як у низькомолекулярного структурного білку (4 S-білку). Вклад розсіювання світла у поглинання, що вимірюється (Е^ср₂₆₀) має складати 18-25%. Методика визначення Е^ср₂₆₀ наведена в лабораторній роботі 2.