Хід роботи

Для вимірів бажано використовувати суспензію вірусів із Е^вим₂₆₀ з 0,8-1,3 оптичної одиниці, щоб величини поглинання у довгохвильовій зоні були достатньо великими для надійних вимірів. Для такої суспензії проводять виміри у цікавій для нас зоні (наприклад, 240-290 нм), а також в екстраполяційній зоні, де суспензія вже не має свого поглинання. В принципі в якості екстраполяційної зони можна вибрати будь-який відрізок при λ > 310 нм, але більш зручним є відрізок 320-350 нм. Мантіси логарифмів величин Е^вим в зоні 320-350 нм (виміри в екстраполяційній зоні проводяться при 320, 325, 330, 340 і 350 нм) відкладають на графіку проти логарифмів відповідних довжин хвиль і отримані точки з’єднують прямою. Цю пряму продовжують до цікавих для нас довжин хвиль (240-290 нм) і за величиною відрізка ординати, що відсікається в цих точках, визначають величину логарифма Е^ср для відповідних довжин хвиль. Потім від логарифмів переходять безпосередньо до величин Е^ср і ці величини віднімають від величин поглинання, вимірених за цих довжин хвиль. Отримана різниця і складає істинну величину поглинання за данної довжини хвилі. Безпосередньо виміряні спектри поглинання і спектри істинного поглинання препаратів фага Сд і ВТМ представлені на рисунках А і Б; на рисунку В наведені екстраполяційні прямі для цих препаратів.

Рис. 1 Визначення дійсного поглинання вірусних суспензій методом екстраполяції: 1 – спектри безпосередньо виміряного поглинання; 2 – спектри дійсного поглинання препаратів фагу С_д (А) та ВТМ (Б); В – екстраполяційні прямі

Необхідно мати на увазі, що оскільки фаг Сд містить 45% нуклеїнової кислоти, а ВТМ – лише 5%, величини поглинання для суспензій цих вірусів різко відрізняються. У випадку фага Сд величина істинного поглинання при 260 нм в кюветі товщиною 1 см для суспензії з концентрацією 1,0 мг/мл складає 10,5 оптичної одиниці. Для ВТМ відповідна величина (що називається коефіцієнтом поглинання – Е^0,1%_{260, 1 см}) складає 2,3 оптичної одиниці. Наведений на рисунку А спектр фага Сд відповдає концентрації вірусу 95,0мкг/мл, а наведений на рисунку Б спектр ВТМ – концентрації 410,0 мкг/мл.

Із рисунків А і Б видно, що фаг Сд і ВТМ сильно відрізняються за формою спектрів. Спектр фага характеризується більшою величиною співвідношення Е^д₂₆₀/Е^д₂₈₀, ніж спектр ВТМ. Ця різниця у формі спектрів також визначається різним відсотковим вмістом білку (білок має максимум поглинання при 280 нм).

Зв’язок між відсотковим вмістом нуклеїнової кислоти в данному вірусі і величиною співвідношення Е^д₂₆₀/Е^д₂₈₀ виражений настільки чітко, що це співвідношення іноді використовується для визначення вмісту нуклеїнової кислоти (чи білку) в препаратах вірусів і інших нуклеопротеїдів. Результати, отримані, за цим способом, є приблизними. Крім того, це використовується виключно для вірусів, які складаються лише з нуклеїнової кислоти і білку.

Порівняння безпосередньо вимірених спектрів і спектрів дійсного поглинання показує, що вклад розсіювання світла збільшується зі зменшенням довжини хвилі. Для характеристики здатності вірусів до розсіювання використовують величину Е^ср₂₆₀ – відношення поглинання, що визначається розсіюванням, до виміряного поглинання при 260 нм. Для очищених препаратів фага Сд Е^ср₂₆₀ складає 22-27%, а для ВТМ – 17-23%. Для інших вірусів ця величина варіює від 3-5 (дрібні сферичні віруси рослин) до 30-35% (Т-парні фаги). Якщо Е^ср₂₆₀ (у % до Е^зм₂₆₀) перевищує величину, характерну для данного вірусу, то це свідчить або про недостатнє очищення препарату (наявність домішок, що мають поглинання в екстраполяційній зоні), або про високий ступінь агрегації вірусних часток. Як показує дослід, при Е^ср₂₆₀, що складає більше 35% від Е^зм₂₆₀, метод екстраполяції дає значну помилку.

Величина Е^ср_260, більш низька, ніж Е^ср_260, характерна для стандартного препарату данного вірусу, засвідчує часткове або повне руйнування вірусних часток у дослідному препараті.