Контрольні запитання

1. Які методи руйнування інфікованих клітин використовують для виділення вірусів?

2. З якою метою проводять освітлення рослинних екстрактів при виділенні вірусів?

3. Який принцип лежить в основі очищення та концентрації вірусів методом висолювання?

4. Який принцип лежить в основі очищення та концентрації вірусів методом осадження в ізоелектричній точці?

5. У чому полягає метод диференційного центрифугування?

Лабораторна робота 2 Визначення спектрів дійсного поглинання втм і фага Сд. Поправка на розсіювання світла вірусної суспензії

Мета: визначити спектри поглинання досліджуваних препаратів ВТМ і фага Сд, порівняти їх із стандартними спектральними характеристиками для даних вірусів та зробити висновок про ступінь чистоти досліджуваних препаратів.

Матеріали та обладнання: спектрофотометр СФ 46, міліметрова бумага, суспензія очищеного препаратів ВТМ і фага Сд, пробірки, піпетки.

Теоретичні відомості

Спектр поглинання ультрафіолетового опромінювання (УФ-спектр) – важлива характеристика вірусного препарату. Для вірусних суспензій УФ-спектри визначають у зоні 240-300 нм. Віруси характеризуються визначеною (більш-менш специфічною для данного вірусу) формою УФ-спектра величиною максимума поглинання, звичайно локалізованого в районі 260 нм. Потому порівняння спектра отриманого препарата із стандартними спектральними характеристиками для данного вірусу дозволяє досить точно визначити його концентрацію і отримати деяку інформацію про ступінь чистоти отриманого препарату.

Більшість білків має максимум поглинання при 280 нм. У зв’язку з цим зменшення спввідношення Е₂₆₀/Е₂₈₀ у виділеному препараті порівняно із стандартною відомою величиною (для чистого вірусу) буде свідчити про наявність в ньому домішку білків (хазяйських або вірусних).

Так як розмір вірусних часток порівнюється із довжиною хвилі світла, що падає, препарати ВТМ і Сд, як і більшості інших вірусів, мають значну здатність до розсіювання світла. Зовнішньо це проявляється в біло-блакитній опалесценції вірусних суспензій, інтенсивність якої залежить від концентрації вірусу.

Відомо, що вимірювання поглинання на спектрофотометрі зводиться до порівняння інтенсивності світла, що пройшло через контрольну кювету з розчинником і через дослідну кювету зі зразком. Прибор фіксує послаблення інтенсивності світла, що пройшло через дослідну кювету, за рахунок його поглинання зразком. У випадку зразків, що не розсіюють світло, ця різниця цілком визначається поглинанням зразка. Однак при аналізі препаратів, що розсіюють світло, послаблення інтенсивності світлового потоку, який пройшов через зразок, буде визначатися не лише поглинанням зразку, але й розсіюванням світла на зразку в різні боки, врезультаті чого значна частина розсіяного світла не потрапить на фотоелемент. Таким чином, для зразків, що розсіюють світло: Е^вим=Е^д+Е^ср, де Е^вим – вимірюване поглинання, Е^д – дійсне поглинання, Е^ср –поглинання, обумовлене світлорозсіюванням. Таким чином, у випадку препаратів, що розсіюють світло, виміри на спектрофотометрі завжди будуть давати підвищені значення поглинання.

Визначення дійсного поглинання суспензій, що розсіюють світло, представляє собою важливу проблему. До теперішнього часу розроблено цілий ряд більш-менш надійних способів визначення дійсного поглинання суспензій, що розсіюють світло, різної (в тому числі і вірусної) природи.

Найбільш відомий з цих методів – метод екстраполяції. Відомо, що компоненти вірусної частки (нуклеїнові кислоти, білки, ліпіди) практично не мають свого поглинання за довжин хвиль > 310 нм, тобто за цих довжин хвиль Е^д=0 і Е^вим=Е^ср.

На перший погляд здається, що для того, щоб визначити Е^д, наприклад, при 260 нм, достатньо від Е^вим₂₆₀ відняти Е^вим₃₂₀, і отримана різниця буде складати Е^д₂₆₀. Однак, у дійсності, відповідно до закону Релєя, здатність до розсіювання світла пов’язана з довжиною хвилі світла, що падає, зворотно пропорційною залежністю. Тому, виміри у тій області, де відсутнє дійсне поглинання, необхідно проводити не при одній, а при декількох довжинах хвиль і отриману залежність Е^ср від λ екстраполювати на цікавий для нас інтервал. Так як відповідно до того ж закону Релєя залежність Е^ср від довжини хвилі описується не лінійною, а ступеневою функцією (Е^ср ~ 1/λ^α), таку екстраполяцію приходиться проводити в логарифмічній шкалі, бо лише в цьому випадку вона буде виражатися прямою лінією. Отриману в результаті цих маніпуляцій величину Е^ср₂₆₀ віднімають від виміряної величини Е^вим₂₆₀ і отримують Е^д₂₆₀.