Хід роботи

1. Отримання очищенного препарату втм

Наважку в 500 г попередньо замороженого (-20⁰С) рослинного матеріалу, інфікованого ВТМ, подрібнюють із додаванням 500 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,5 з 0,01 М ЕДТА.

Після того як отримана маса відтає, її віджимають у склянку. Віджату масу знову змішують із 0,5 л того ж буфера, додають порошку електрокорунда, суміш розтирають 15 хв в фарфоровій ступці, віджимають сок і об’єднують перший і другтй екстракти. Суспензію вилужують 0,1 н NaOH до рН 7,0-7,5, контролюючи рН, і центрифугують 20 хв при 3-5 тис. об/хв на центрифузі з охолодженням.

Після центрифугування прозору надосадову рідину виливають у склянку і додають 1/10 (за об‘ємом) частину хлороформу. Суміш струшують протягом 15-20 хв і знову центрифугують 10 хв у стаканах на 500 мл при 3-5 тис. об/хв. Після такого центрифугування утворюється 3 шари. Нижній шар містить забарвлений пігментом хлороформ, другий (інтерфаза) денатуровані хлороформом баластні речовини і верхній (прозорий) – частково очищенний екстракт, що містить вірусні частки.

Очищений верхній шар екстракту зливають і обробку хлороформом повторюють ще рах. З отриманого таким чином очищеного екстракта виділяють вірус за методом дробного висолювання.

До частково очищеного вірусного екстракту додають невеликими порціями при постійному перемішуванні суху сіль сульфату амонію (до 15% насичення). Кожну наступну порцію солі додаюь тільки після розчинення наступної. Після додавання всієї кількості солі суміш інкубують при кімнатній температурі не менше 30 хв. При цьому в осад випадає значна частина баластних компонентів. Осад видаляють центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 20 хв. До отриманого екстракту знову додають сульфат амонію до 25-30% насичення. В ході інкубації утворюються вірусні паракристали, які надають розчину шовкового блиску.

Склянку з розчином залишають на ніч у холодильнику для повної кристалізації і осадження вірусу. Потім надосадову рідину за допомогою сифонної трубки видаляють майже повністю, а рідку суспензію вірусного залишку центрифугують при 6000 об/хв протягом 15 хв. Надосадову рідину, що не містить вірусних паракристалів, зливають, а вірусний осад суспендують в 100 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,5 з 0,005 М ЕДТА, що складає приблизно 1/10 частину початкового об’єму екстракту. Наступна стадія очищення віруса – діаліз. У ході діаліза відбувається видалення іонів солі, а також денатурація і перехід у нерозчинний стан частини баластних речовин рослинного походження, що забезпечує більш повне очищення вірусного препарату.

Діалізний мішечок прикріплюють на штативі, нижню частину мішечка опускають у склянку, заповнену відповідним буферним розчином чи водою. Через маленьку воронку суспензію вірусу переносять в діалізний мішечок, залишки суспензії змивають 2-3 мл буферного розчину і переносять у той же мішечок.

Діалізний мішечок встановлюють так, щоб рівень рідини в ньому був на 2-3 мл вище рівня діалізного розчину в склянці. Склянку встановлюють на магнітну мішалку і діаліз проводять протягом доби з трикратною зміною діалізуючої рідини. Віддіалізований препарат зливають і центрифугують 10 хв при 15-18 тис. об/хв для видалення осаду, що нерозчинився. Надосадову рідину, що містить вірус, зливають в хімічний стакан, осад суспендують у 2-3 мл 0,01 М буферного розчину, рН 7,5, і знову центрифугують, промивні води об’єднують з основним розчином, а осад відкидають.

Отримана суспензія вірусу використовується для повторного висолювання. Для цього до суспензії додають (при помішуванні) рівний об’єм насиченого розчину сульфата амонію і суміш поміщають в льодову баню на 15-20 хв до повної кристалізації вірусу. Вірусні кристали відділяють центрифугуванням протягом 20 хв при 6 тис. об/хв; надосадову рідину зливають, центрифужні стаканчики перевертають на листок фільтрувального паперу і дають повністю зтекти сольовому розчину. Осад вірусу ресуспендують в 20 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,5, і центрифугують при 15-18 тис. об/хв для видалення нерозчинного матеріалу. Цей матеріал промивають 2-5 мл 0,01 М фосфатного буфера і знову центрифугують; основний розчин і промивні води об’єднують. Таким чином отримують частково очищений вірусний препарат. Для подальшого його очищення можна застосовувати методи хроматографії та центрифугування у градієнті щільності тощо.

2. Отримання очищенного препарату бактеріофага Сд

Бактеріофаг Сд відноситься до групи ДНК-вмісних вірусів. Віріони бактеріофага Сд мають булавовидну форму (голівка з коротким хвостовим відростком).

Фаг Сд вирощується на клітинах E.coli СК. Після завершення реплікації фага і лізиса клітин лізат зливають з ферментерів і центрифугують 10-15 хв при 2-3 тис. об/хв для осадження незруйнованих клітин і крупних компонентів лізованих клітин. Просвітлений низькошвидкісним центрифугуванням лізат використовують для подальшого очищення.

Перший етап подальшого очищення складається в осадженні фага сульфатом амонію. Для цього до суспензії фага додають твердий сульфат амонію до 20% насичення (тобто до концентрації 8,6 г солі на 100 мл суспензії) або ¼ вихідного об’єму насиченого розсину сульфату амонію. Суспензію витримують на холоді протягом 1 год і центрифугують 15 хв при 5 тис. об/хв. До супернатанту додають сульфат амонію з таким розрахунком, щоб його кінцева концентрація складала 45% від насичення, або 19,4 г на 100 мл суспензії (при цьому необхідно враховувати раніше додану сіль). Після інкубації на холоді суспензію знову центрифугують (в тому ж режимі), осад фага збирають і ресуспендують в 0,1 М NaCl з 0,05 М фосфатним буфером, рН=7,0.

Для очищення фага шляхом осадження в ізоелектричній точці до вихідної суспензії додають 0,1 н НСl при постійному перемішуванні до рН 5,2. Суспензію витримують 1 год на холоді, центрифугують, осад видаляють, а до насодової рідини знову додають НСl до рН 4,1. Після інкубації на холоді суспензію центрифугують і осад фага ресуспендують в 0,1 М NaCl з 0,05 М фосфатним буфером, рН=7,0.

Подальше очищення здійснюють за допомогою хроматографії на колонках з ДЕАЕ-целюлозою. Бажано використовувати обмінник на основі волокнистої целюлози.

Вихідний препарат ДЕАЕ целюлози суспендують в 0,5 н НСl, перемішують і після 15-хвилинної інкубації обмінник осаджують центрифугуванням (15 хв, 3000 об/хв). Осад ресуспендують в 0,5 н NaОН і інкубують 30 хв. Потім обмінник осаджують центрифугуванням і декілька разів промивають 0,05 М фосфатним буфером, рН 7,0. Після цього обмінник наносять на колонку і продовжують відмивку буфером до нейтральної реакції у рідині, що відтікає. У якості колонок в данному випадку використовують воронки об’ємом 100-300 мл з прокладкою з декількох шарів марлі. Для очищення фага використовують колонки з незначним відношенням висоти до діаметра (1:d = 3:1–5:1), така колонка менше забивається при пропусканні суспензії. При аналітичній колоночній хроматографії використовують колонки з більшою величиною співвідношення 1:d, так як в цих умовах забезпечується кращий розподіл компонентів.

Після закінчення заповнення і промивання колонки на неї наноситься фаголізат (при цьому необхідно слідкувати за тим, щоб колонка не пересихала). Лізат наносять зі швидкістю 50-100 мл/год до насичення колонки. Момент насичення фіксується за появою опалесценції у фільтраті. Потім колонку промивають 100-200 мл 0,1 М NaСl в 0,05 М фосфатному буфері, рН 7,0. Елюцію фага з колонки здійснюють шляхом пропускання 0,5 М NaСl в 0,05 М фосфатному буфері. Рідину, що віддтікає з колонки, збирають в пробірки фракціями по 5-10 мл. Бактеріофаг елююється з колонки у вигляді декількох опалесціюючих фракцій. Фракції, що вілповідають середині і «хвостам» зони опалесценції, збирають окремо. Після закінчення процесу елюції колонку промивають 200 мл 0,5 н NaОН і потім 0,05 М фосфатним буфером, рН 7,0, до нейтральної реакції.

В ході очищення вимірюють на спектрофотометрі Е₂₆₀ і Е₂₈₀ і визначають об’єм вихідної суспензії, рідини, що відтікає з колонки, промивних вод, «піка» і «хвостів» елюата, 0,5 н NaОН і на основі величин поглинання і об’єма всіх фракцій визначають відсоток матеріала, який поглинає УФ, у кожній з них відносно до вихідної суспензії. Ця процедура дозволяє оцінити вміст фага у вихідній суспензії.

Подальше очищення фага здійснюється за допомогою диференціального центрифугування. «Пік» і «хвости», зняті з колонки, центрифугують 40 хв при 18-20 тис. об/хв. Осад фага ресуспендують у 0,1 М NaСl в 0,05 М фосфатному буфері, перемішують протягом декількох годин на магнітній мішалці і центрифугують 15 хв при 6 тис. об/хв. Осад видаляють, а надосадову рідину використовують для подальшої роботи. Щоб попередити бактеріальну контамінацію суспензії, до неї додають декілька крапель хлороформу.