22

Описано провідні методи отримання та очищення вірусів рослин і бактеріофагів, препаративного виділення вірусних РНК і білків, визначення спектрів дійсного поглинання вірусних суспензій, реполімеризації вірусних білків та реконструкції вірусних часток in vitro. Наведено принципи роботи електронного мікроскопа і схеми приготування препаратів для оцінки ефективності проведеної реполімеризації вірусного білкута та визначення форми реконструйованих вірусних часток. Розглянуто метод визначення питомої інфекційності препаратів нативного вірусу, нуклеїнових кислот і вірусоподібних агрегатів, отриманих реконструкцією in vitro.

Для студентів ДНУ, які навчаються за спеціальністю «Вірусологія».

Темплан

Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт із курсу «Молекулярна біофізика вірусів»

Укладачі: канд. біол. наук О.А. Дрегваль

канд. біол. наук К.В. Лаврентьєва

д-р біол. наук, проф. А.І. Вінніков

Редактор

Техредактор

Коректор

____________________________________________________________________________

Підписано до друку Формат 60х84/16. Папір друкарський. Друк плоский. Ум. друк. арк. Ум. фарбовідб. 1,9. Обл.-вид. арк. Тираж 100 пр.

Зам.№

____________________________________________________________________________

РВВ ДНУ, просп. Гагаріна, 72, м. Дніпропетровськ, 49010.

Друкарня ДНУ, вул. Наукова, 5, м. Дніпропетровськ, 49050

Лабораторна робота 1 Виділення очищенних препаратів вірусу тютюнової мозаїки та бактеріофагу Сд

Мета: отримати очищені препарати вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ) та бактеріофагу С_д.

Матеріали та обладнання: рослини тютюну Nicotiana tabacum із симптомами вірусного захворювання, фаголізат Escherichia coli СК, 0,1 М Na-фосфатний буфер, рН 7,5; ЕДТА (версен); 0,1 н HСl; 1 н HCl; 0,1 н NaOH; 1 н NaOH; 0,05 М трис-HCl буфер, рН 7,6; сульфат амонію; хлороформ, ДЕАЕ-целюлоза; стакани: на 3 л – 1 шт., 1 л – 1 шт., 0,05-0,5 л – за потребою, пробірки, скляні палички, фарфорова ступка, сосуди для емульгування, сифон для відсмоктування рідини, рефрижераторна центрифуга (ЦЛР-1), центрифужні пробірки об’ємом на 500 мл, 250 мл, 100 мл, 10 мл і відповідні кутові ротори, магнітна мішалка, целофан для діалізного мішечка, рН-метр, фізичні штативи, ваги для врівноваження пробірок, холодильна камера (до -20⁰С).

Теоретичні відомості

Виділення та очищення вірусів з інфікованих клітин-хазяїв є невід’ємною частиною будь-яких вірусологічних експериментів. Чистий вірусний препарат повинен містити віріони відповідного вірусу, ідентичні за розміром, морфологією, хімічним складом, біологічними та фізичними властивостями. Безпосередньо сам процес отримання вірусного препарату включає в себе цілий комплекс заходів, спрямованих на виділення віріонів із клітин-хазяїв, концентрування та очищення.

Першим етапом виділення вірусів є руйнування клітин-хазяїв для екстракції вірусу з інфікованого матеріалу. Руйнування здійснюють механічним (гомогенізацією, обробкою ультразвуком, перетиранням у ступці з абразивним матеріалом) або хімічним (обробка хлороформом, лізоцимом тощо) способами. Механічні способи руйнування найчастіше використовуються для виділення рослинних вірусів, хімічні – для бактеріофагів.

Механічне подрібнення рослинних тканин проводиться з додаванням буферного розчину для підтримання постійного значення рН, оскільки при перетиранні вивільняються рослинні ферменти, які сприяють зниженню рН і безпосередньо руйнують віріони. Тому у буферні розчини рекомендується додавати хелатуючі речовини (ЕДТА) для інактивації рослинних ферментів. Слід зазначити, що руйнування тканини і всі наступні операції з виділення та очищення вірусів, повинні проводитися на холоді. Для освітлення рослинного екстракту (видалення пігментів) найчастіше використовують хлороформ або суміш хлороформу з бутанолом.

На наступному етапі проводять низькошвидкісне центрифугування отриманої суспензії (рослинної або бактеріальної) для видалення фрагментів клітин, що є першою стадією очищення, але не концентрування вірусу.

Концентрування вірусу здійснюють декількома методами, серед яких:

• осадження вірусу в ізоелектричній точці;

• висолювання;

• діаліз;

• хроматографія (іонообмінна, афінна);

• диференційне центрифугування (з етапом ультрацентрифугування).

Осадження вірусу в ізоелектричній точці. Для кожного вірусу властиве своє значення ізоелектричної точки (таке рН розчину, при якому врівноважуються позитивні та негативні заряди поверхні віріонів і вони випадають в осад). Ізоелектрична точка більшості вірусів знаходиться в кислій зоні (рН 3,5 – 6,0). Метод осадження в ізоелектричній точці можна застосовувати у простому варіанті, доводячи рН суспензії до потрібного значення і видаляючи преципітат вірусу низькошвидкісним центрифугуванням. Недоліком методу є порівняно малий вихід вірусу (не всі віріони випадають в осад), а також те, що деякі віруси є чутливими до зміни рН, що може призвести до руйнування віріонів.

Висолювання. Білкова оболонка вірусу має зовні гідрофобні зони (їх наявність зумовлена амінокислотним складом капсидних білків), які впорядковують навколо себе молекули води у розчині буферу. Внесення у суспензію солей у дуже високих концентраціях призводить до того, що іони солі сольватуються (тобто, відтягують на себе вільні молекули води) і гідрофобні зони капсидних білків вірусу втрачають молекули води. Наслідком цього є агрегація віріонів та їх випадання в осад. Для висолювання найчастіше використовують сульфати та фосфати, наприклад, сульфат амонію. Недоліком методу може бути відсутність у зовнішніх ділянках капсиду гідрофобних амінокислот, і тоді, навіть, при високих концентраціях солі вірус не випадатиме в осад.

Діаліз. Видалення низькомолекулярних домішок із розчинів високомолекулярних сполук внаслідок дифузії через напівпроникну мембрану, яка пропускає невеликі молекули та іони, але затримує макромолекули, називається діалізом. У ході діалізу відбувається видалення іонів солі, а також денатурація і перехід у нерозчинний стан частки баластних речовин, що забезпечує більш повне очищення вірусного препарату.

Хроматографія. Цей метод очищення дозволяє підвищити титр вірусу та видалити значну частину клітинних домішок. Для іонної хроматографії використовують слабкі аніоннообмінники типу похідних целюлози (ДЕАЕ, ТЕАЕ-целюлоза), які зворотно зв’язують вірусні частки. Елюцію вірусів з колонки здійснюють гражієнтом концентрації солі або рН, оскільки поверхневий заряд віріона змінюється внаслідок зміни рН і концентрації іонів.

У випадку використання афінної хроматографії колонку заповнюють нерозчинним носієм з ковалентно зв’язаними лігандами, що специфічно взаємодіють із вірусним білком. Його виділяють зміною іонної сили, рН буферного розчину або введенням денатуруючих агентів.

Диференційне центрифугування. Суть методу полягає у чергуванні низькошвидкісного та високошвидкісного центрифугування. При низькошвидкісному центрифугуванні видаляються великі клітинні компоненти (5-10 тис. об/хв, 15-30 хв). Надалі здійснюють високошвидкісне центрифугування (30 тис. об/хв, 1-24 год). Після цього, отриманий осад, що містить зконцентрований вірус, розчиняють у мінімальному об’ємі буферу, який надалі знову центрифугують на малих швидкостях для видалення неочищенних раніше клітинних компонентів. Для високого ступеню очищення проводять декілька циклів диференційного центрифугування.