Стратегии защиты свежевыделенных ферментов

Помимо стабилизированных ферментов, в почве имеется постоянный приток только что выделенных (свежих) энзимов почвенной биоты, которые не потеряли своей активности. Среди исследователей нет единого мнения о продолжительности времени, в течение которого такие не стабилизированные ферменты сохраняют свою активность. Долгое время считалось, что ферменты, которые сразу же не подвергаются процессу иммобилизации, теряют свою активность через несколько минут или даже секунд после выделения продуцентом во внешнюю среду. Это связано с тем, что другие микроорганизмы используют такие ферменты в качестве источника питания. Современные исследования показали, что быстрый протеолиз свежих экстрацеллюлярных ферментов, по-видимому, происходит в почве далеко не всегда. Основой для такого заключения служит тот факт, что продуцент выделяет экстрацеллюлярный фермент для своих нужд и заинтересован в том, чтобы его активность сохранялась как можно дольше. Только при таком условии продуцент сможет воспользоваться продуктами реакции, которую катализирует данный энзим. Поэтому микроорганизмы, выделяющие ферменты, реализуют стратегии их защиты, которые обеспечивют снижение конкуренции со стороны других обитателей почвы.

Одна из таких стратегий заключается в том, чтобы связать выделенный фермент с внешней поверхностью клетки продуцента. В этом случае продукты реакции, катализируемой данным ферментом, не будут утеряны для продуцента. Другая стратегия заключается в химической защите фермента продуцентом, когда последний выделяет антибиотики для уничтожения конкурентов за продукты реакции. Еще одним видом защиты может быть объединение продуцента с другими микроорганизмами, выделяющими ферменты. Если такое объединение происходит непосредственно в почве, то микроорганизмы образуют агрегаты разного размера и структуры. В случае объединения на корнях, продуценты образуются так называемые биопленки, в которых колонии разных видов микроорганизмов покрыты общим полисахаридным чехлом. Такая стратегия повышает шансы продуцентов получить максимальное количество продуктов реакции до того, как они рассеются в почве. Подобную стратегию используют некоторые микоризные грибы: они образуют гидрофобные маты из гиф, которые обильно увлажнены. Гриб выделяет ферменты во влагу, покрывающую маты, а затем энзимы реабсорбируются этим микроорганизмом вместе с продуктами реакции.

Если энзим не связан с поверхностью клетки, то продуцент может уменьшить его потери путем снижения диффузии фермента в почвенную среду. Возможность применения такой стратегии основана на том, что диффузионные свойства энзима зависят от размера и структуры его молекулы. Благодаря механизмам, выработанным в процессе эволюции, микроорганизм-продуцент способен синтезировать нескольких изоферментов, которые катализируют одну и ту же реакцию, но имеют разную химическую структуру и, соответственно, другие диффузионные свойства. Таким образом, микроорганизм может «выбрать» из набора доступных ему изоферментов именно тот, который будет иметь наименьшую скорость диффузии в конкретных почвенных условиях. Дополнительно микроорганизмы могут синтезировать так называемые молекулы-автоиндукторы, позволяющие продуцентам «оценить» способность окружающей среды адсорбировать экскретированный фермент. Предполагается, что автоиндукторы предназначены для определения скорости движения выделенной молекулы фермента от клетки продуцента. Кроме того, автоиндукторы, по-видимому, помогают микроорганизмам определить момент, когда диффузионный уровень окружающей среды наиболее благоприятен для синтеза экстрацеллюлярных ферментов.

Таким образом, на основании полученной в последнее десятилетие информации, следует признать, что свежие (не стабилизированные) ферменты могут играть важную роль в функционировании ферментного пула. В связи с этим является дискуссионным вопрос о вкладе стабилизированных и свежих ферментов в каталитическую систему почвы. Долгое время считалось, что основой ферментативной активности почвы являются иммобилизованные ферменты. Однако новейшие исследования не подтвердили предполагаемую корреляцию между численностью, а также активностью микрофлоры и ферментативной активностью почвы, обусловленной иммобилизованными энзимами. Кроме того, активность пула стабилизированных ферментов существенно не изменяется при глубоком нарушении или, наоборот, процветании микробного сообщества. Поэтому возникло предположение, что пул стабилизированных ферментов является, в известной степени, функционально пассивным. Следует признать, что на современном этапе своего развития почвенная энзимология не располагает достаточной информацией для создания теории, объединяющей и объясняющей все имеющиеся факты.

Лекция четвертая

Разложение сложных органических безазотистых веществ

Разложение целлюлозы

Целлюлоза – самое распространенное органическое соединение в природе. Ее создают в основном высшие растения, которые на 60 – 70% состоят из целлюлозы. Очень немногие другие организмы синтезируют целлюлозу: грибы (кл.Oomycetes), редкие бактерии (уксуснокислые клубеньковые), термиты, моллюски, личинки жуков. Синтез целлюлозы происходит комплементарно с ее разложением микроорганизмами. Это – естественный природный деструкционный процесс. В нем микроорганизмы выступают биогеохимическими агентами, возвращая углерод в атмосферу в виде СО₂. Ни животные, ни растения не способны разлагать целлюлозу. В связи с большим количеством синтезируемой в природе целлюлозы роль микроорганизмов, ее разлагающих, очень велика. Бактерии, способные разлагать целлюлозу, широко представлены в почве. К аэробным целлюлозоразлагающим микроорганизмам относятся роды Cytophaga, Acetivibrio, Bacillus, Errkinea, Sporacytophaga. В расщеплении целлюлозы принимают участие миксобактерии (роды Myxococcus, Sorangium, Polyangium). Могут усваивать целлюлозу некоторые виды Pseudomonas. К актиномицетам, разлагающим целлюлозу относятся роды: Streptomyces, Actinomyces, Streptosporangium, Micromonospora, к грибам – роды Fusarium, Chaetomium, виды Trichoderma viride, Aspergillus fumigatus, Botrytis cinerea, Rizoctonia solani, Myrothecium verrucaria.

Большинство анаэробных целлюлозоразлагающих бактерий относится к семейству Bacillaceae, роду Clostridium, а также к родам Butyrivibrio, Fibrobacter и др. Эти виды обитают в почвах, компостах, навозе, илах и сточных водах.

Молекула целлюлозы представляет собой линейный полимер, содержащий от 100 до 10000 остатков глюкозы, соединенных β-1,4-связью. В полимерной цепи целлюлозы каждый остаток глюкозы повернут относительно соседнего на 180⁰. Такую повторяющуюся пару остатков в составе целлюлозы называют целлобиозой. Целлюлозные цепи связаны между собой водородными связями, формируют нерастворимые в воде фибриллы, содержащие кристаллические структуры и аморфные рыхлые участки.

Целлобиоза Глюкоза

Кристаллический Аморфный Кристаллический

участок участок участок

Строение целлюлозы.

Целлюлозные микрофибрилы объединены в более толстые волокна, которые погружены в матрикс из гемицеллюлозы и лигнина. Образуется единый комплекс – лигнин-гемицеллюлоза.

В расщеплении целлюлозы принимают участие многочисленные ферменты под общим названием целлюлазы. Главнейшими из них являются 3 фермента. Первый – эндоглюканаза – разрывает связи внутри макромолекулы, при этом образуются фрагменты со свободными концами. Второй фермент – экзоглюканаза – отщепляет от конца цепочки дисахарид – целлобиозу. Третий фермент – глюкозидаза – осуществляет гидролиз с образованием глюкозы:

эндоглюканаза экзоглюканаза глюкозидаза

ц еллюлоза отдельные целлобиоза

ферменты (дисахарид)

глюкоза СО₂ + Н₂О

Целлюлолитические ферменты относятся к гликозилгидралазам. Гены этих ферментов могут передаваться от одних микроорганизмов другим путем горизонтального переноса либо другим способом.