4. Количественное содержание ксантонов в траве золототысячника:
- получают извлечение подкисленным 60%-ным этанолом;
2 мл извлечения наносят на колонку с полиамидным сорбентом;
- элюируют ксантоны 95%-м этанолом и собирают окрашенный в желтый цвет элюат в мерную колбу на 50 мл;
- получают окрашенный комплекс с алюминия хлоридом;
- измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса;
- параллельно измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса ГСО алпизарина с алюминия хлоридом;
- пересчитывают на алпизарин с учетом оптической плотности комплекса ГСО алпизарина с алюминия хлоридом.
Количественное определение.
В последние годы все большее распространение получают различные:
1. физико-химические методы анализа, которые имеют ряд существенных преимуществ в сравнении, например, с гравиметрическими и титрометрическими методами, а именно, быстрота и точность определения, обнаружение даже незначительных количеств и, что особенно важно, возможность выделения отдельных флавоноидов из растительного сырья.
К таким методам относятся фотоэлектроколориметрия, спектрофотометрия, денситометрия с использованием хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента.
Сущность хроматоденситометрического метода заключается в выделении и разделении флавоноидов с непосредственной количественной денситометрической оценкой окрашенной зоны на хроматограмме.
Метод имеет преимущества в быстроте проведения анализа и точности определения, так как в данном случае исключается стадия элюирования.
Используется фотоколориметрический метод, основанный на измерении оптической плотности окрашенных растворов, полученных в цветных реакциях флавоноидов с солями различных металлов (алюминия, циркония, титана, хрома, сурьмы), с лимонно-борным реактивом и на реакции восстановления цинком или магнием в кислой среде.
Известна цветная реакция флавоноидов с азотнокислым и уксуснокислым уранилом, позволяющая количественно определять рутин в смеси с кверцитином.
В настоящее время широко используется метод спектрофотометричекий.
10. Методы анализа кумаринов
Для обнаружения кумаринов в растительном сырье проводят качественные реакции и хроматографическое исследование, используя лактонные свойства кумаринов:
- вступать в реакцию разрыва лактонного кольца (лактонная проба);
- давать окрашенные растворы с диазосоединениями;
- флуоресцировать в УФ-свете.
Качественный анализ
1. Лактонная проба (предложена Г.А.Кузнецовой). Параллельно проводят контрольный опыт.
Методика: 1 мл извлечения, содержащего кумарины, наливают в две пробирки.
В одну добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора натрия гидроксида.
Обе пробирки нагревают на водяной бане, затем в обе прибавляют 4 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают.
Если в пробирке, куда добавляли щелочь, раствор остался желтым и прозрачным, значит, реакция положительная, так как образуется желтая растворимая в воде соль кумаровой кислоты.
В контрольной пробирке при добавлении воды раствор мутнеет, кумарины не растворяются в воде и выпадают в осадок.
При подкислении щелочного раствора лактонное кольцо замыкается и кумарины выпадают в осадок.
2. Реакция образования азокрасителя. Реакция проводится с продуктами, полученными после реакции разрыва лактонного кольца.
Методика: В пробирку добавляют 1 мл свежеприготовленного диазореактива. Чаще всего, в качестве диазореактива используют диазосульфаниловую кислоту. Образуется азокраситель от желтого до вишнево-красного цвета.
Для идентификации кумаринов используют методы бумажной и тонкослойной хроматографии. При этом используют системы растворителей:
- н-бутанол-уксусная кислота-вода БУВ (4:1:5)
- н-гексан-бензол-метанол (5:4:1);
- петролейный эфир-бензол-метанол (5:4:1);
Идентифицируют кумарины по характерной флюоресценции в УФ свете или проявляют хромогенными реактивами.
В качестве проявляющих реактивов служат 1%-ный спиртовый раствор алюминия хлорида, 10%-ный раствор щелочи или пары аммиака.
Широкие возможности для обнаружения в растениях и сырье кумаринов, не только их суммы, но и отдельных соединений, открылись после внедрения хроматографического анализа. При этом указанные реактивы используют и для обработки хроматограмм.
4. Хроматографические методы удобны для выделения индивидуальных кумаринов.
Количественное определение.
Для количественного определения кумаринов в лекарственном РС используют гравиметрические, титриметрические и физико- химические методы анализа.
По существующей нормативной документации для количественного определения кумаринов в лекарственном растительного сырье используют физико-химические методы анализа.
1. Полярографический метод. Определение кумаринов в плодах пастернака.
Основан на восстановлении кумаринов на ртутно-капельном электроде в альфа-пироновом кольце по месту двойной связи в положении 3,4. Присоединяют галоген - йод, в качестве реактива используют тетраэтиламмоний йодид. Содержание комариное в пересчете на ксантотоксин не менее 1%.
Спектрофотометрический метод. Основан на способности кумаринов поглощать монохроматический свет при определенной длине волны в зависимости от концентрации исследуемого раствора. Используют
для определения содержания простых кумаринов в траве донника лекарственного (не менее 0.4%) и пиранокумаринов в корневищах и корнях вздутоплодника сибирского (не менее 3 %). Получают хлороформное извлечение из сырья и измеряют у него оптическую плотность с помощью спектрофотометра.
3. Хроматоспектрофотометрический метод. Применяют для определения содержания фуранокумаринов в плодах амми большой, псоралеи костянковой, листьях инжира.
Стадии определения:
1. Получение хлороформного извлечения из сырья.
2. Разделение суммы кумаринов методом хроматографии на бумаге в системе растворителей, указанной в нормативной документации.
3. Идентификация кумаринов в УФ-свете по характерному свечению.
4. Элюирование веществ с бумаги. Каждое вещество отдельно элюируют 95 %-ным этанолом.
5. Измерение оптической плотности растворов с помощью спектрофотометра при длине волны, указанной в нормативной документации.
6. Расчет содержание каждого соединения с учетом удельного показателя поглощения.
Плоды амми большой: бергаптена и изопимпинеллина не менее 0,6 %.
Плоды псоралеи костянковой: псоралена и изопсоралена не менее 0,9 %.
Листья инжира: псоралена и бергаптена не менее 0,7%, отдельно псоралена менее 0,42 %.
4. Гравиметрический (весовой) метод.
Основан на избирательной растворимости отдельных кумаринов в различных растворителях и способности лактонного кольца кумарина к раскрытию и обратному замыканию в зависимости от рН среды.
Используется редко только для определения суммы кумаринов.
5. Фотоэпектроколориметрический метод.
Основан на измерении оптической плотности окрашенного раствора, полученного по реакции азосочетания с солями диазония при определенной длине волны.
Содержание суммы кумаринов рассчитывают по калибровочному графику, построенному по известному веществу.
Алкалоиды - Различают
общие качественные реакции, с помощью которых доказывается присутствие алкалоидов в сырье или в извлечении из сырья, и
частные качественные реакции, с помощью которых доказывают или индивидуальный алкалоид или определенную группу алкалоидов.
Общие реакции –
это либо реакции осаждения, либо реакции окрашивания.
Реакции осаждения основаны на способности алкалоидов к комплексообразованию. Образующиеся комплексы нерастворимы или мало растворимы в воде.
Общеалкалоидные осадочные реактивы можно разделить на несколько групп: