Вопрос 3. Этапы идентификации микроорганизмов.

При описании и идентификации бактерий изучают их культуральные свойства, морфологию, организацию клетки, физиолого-биохимические особенности, химический состав клеток, содержа­ние гуанина и цитозина (ГЦ) в ДНК и другие фено- и генотипические признаки. При этом необходимо соблюдать следующие пра­вила, работать с чистыми культурами, применять стандартные методы исследования, а также использовать для инокуляции клетки, находящиеся в активном физиологическом состоянии.

Культуральные свойства, т. е. характерные особенности роста бактерий на плотных и жидких питательных средах обычно используют для их характеристики, однако для идентифи­кации применяют довольно редко.

Морфологическая характеристика и организация клеток бак­терий включает такие признаки, как форма и размеры клеток, их подвижность, наличие жгутиков и тип жгутикования, способность к спорообразованию. Полезным может оказаться также выявление в клетках характерных мембранных систем и органелл (хлоросом, карбоксисом, фикобилисом, газовых вакуо­лей и т. д.), присущих отдельным группам бактерий, а также включений (параспоральных телец, гранул волютина, поли-($-гид-роксибутирата, полисахаридов и т. д.). Первостепенное значение для систематики бактерий придается окраске клеток по Граму и строению их клеточных стенок.

Физиолого-биохимические свойства включают прежде всего

установление способа питания исследуемой бактерии (фото/хемо-, авто/гетеротрофия) и типа энергетического метаболизма (способ­ность к брожению, аэробному или анаэробному дыханию или фо­тосинтезу). Важно определить такие признаки, как отношение бактерии к молекулярному кислороду, температуре, рН среды, со­лености, освещенности и другим факторам среды В данную груп­пу признаков входит также перечень субстратов, утилизируемых в качестве источников углерода, азота и серы, потребность в вита­минах и других факторах роста, образование характерных про­дуктов метаболизма, наличие некоторых ферментов. Для этого используют специальные тесты. Каждый признак обозначают определенной цифрой, поэтому полученные данные можно ввести в компьютер с соответствующей программой и получить ответ о таксономическом положении исследуемого штамма.

При идентификации симбиотических и паразитических (пато­генных) бактерий важно установить специфичность симбионта к хозяину, а также устойчивость к антимикробным веществам и фа­гам (фаготипирование).

Определение состава клеток бактерий также имеет значение для их систематики (хемосистематика). Хемотаксономические ме­тоды могут быть важными, в частности, для тех групп бактерий, у которых морфологические и физиологические характеристики ши­роко варьируются и недостаточны для проведения их удовлетво­рительной идентификации. В состав клеточных стенок разных прокариот входит несколько классов уникальных гетерополимеров: муреин (или псевдомуреин), липополисахариды, миколовые и тейхоевые кислоты. Состав клеточной стенки 'определяет и серо­логические свойства бактерий. Это лежит в основе иммунохими-ческих методов их идентификации.

В качестве хемотаксономического маркера иногда используют также липидный и жирнокислотный состав клеток бактерий. Ин­тенсивное изучение жирных кислот стало возможным с развити­ем метода газо-хроматографического анализа. Различия в Соста­ве липидов используют для идентификации бактерий на уровне рода и даже вида. Однако этот метод имеет определенные огра­ничения, поскольку содержание жирных кислот в клетках может зависеть от условий культивирования и возраста культуры.

В систематике некоторых бактерий учитывается состав хино-нов и других переносчиков электронов, а также пигментов.

Важная информация о взаимном родстве бактерий может быть получена при изучении клеточных белков — продуктов трансля­ции генов На основании изучения мембранных, рибосомных, сум­марных клеточных белков, а также отдельных ферментов сфор­мировалось новое направление — белковая таксономия. Спектры рибосомных белков относятся к числу наиболее стабильных и ис­пользуются для идентификации бактерий на уровне семейства или порядка Спектры мембранных белков могут отражать родо­вые, видовые и даже внутривидовые различия. Однако характе­ристики химических соединений клетки не могут использоваться для идентификации бактерий изолированно от других данных, опи­сывающих фенотип, поскольку нет критерия оценки значимости фенотипических признаков.

Нередко при идентификации бактерий, а иногда и других микроорганизмов, например дрожжей, используют метод нумернческой (или адансоновской) таксономии. В ее основе лежат идеи французского ботаника М. Адансона (М. Ас1ап50п), предложив­шего различные фенотипические признаки, поддающиеся учету, считать равноценными, что позволяет количественно выразить таксономические дистанции между организмами в виде отноше­ния числа положительных признаков к общему числу изученных. Сходство между двумя исследуемыми организмами определяется путем количественной оценки возможно большего числа (обычноне менее ста) фенотипических признаков, которые подбирают так, чтобы их варианты были альтернативными и могли обозначаться знаками «минус» или «плюс». Степень сходства устанавливается на основании количества совпадающих

Коэффициент! означает полную идентичность, а 0 — полное несходство. Оценки комбинаций признаков производят с помощью компьютера. Полу­ченные результаты представляют в виде матрицы сходства и/или в виде дендрограммы. Нумерическая таксономия может приме­няться при оценке сходства между таксонами микроорганизмов только невысокого ранга (роды, виды). Она не позволяет делать непосредственные выводы относительно генетического родства мик­роорганизмов, однако в известной степени отражает их филогене­тические свойства. Так, установлено, что фенотипические призна­ки бактерий, поддающиеся изучению в настоящее время, отра­жают от 5 до 20% свойств их генотипа.

Изучение генотипа Исследование генотипа, основан­ное на анализе нуклеиновых кислот, в принципе дает возможность построить со временем естественную (филогенетическую) систему микроорганизмов.

Молекулярное содержание ГЦ от общего количества основа­ний ДНК у прокариот, как уже указывалось, колеблется от 25 до 75%. Каждый вид бактерий имеет ДНК с характерным средним содержанием ГЦ. Однако поскольку генетический код вырожден, а генетическое кодирование основано не только на содержании нуклеотидных оснований в единицах кодирования (триплетах), но и на их взаимном расположении, то одинаковое среднее содер­жание ГЦ в ДНК двух видов бактерий может сопровождаться их значительным генотипическим разделением. Если два организ­ма очень близки по нуклеотидному составу ДНК, то это может являться свидетельством их эволюционного родства только при условии, что они обладают большим числом общих фенотипичес­ких признаков или генетическим сходством, подтвержденным другими методами. В то же время расхождение (более 10—15%) в нуклеотидном составе ДНК двух штаммов бактерий с общими фенотипическими свойствами показывает, что они относятся по крайней мере к разным видам.

Метод ДНК—ДНК гибридизации является более важным для оценки генетического родства бактерий. При тщательном прове­дении экспериментов можно получить ценную информацию о сте­пени их генетической гомологии. Внутри одного вида бактерий степень генетической гомологии штаммов достигает 70—100%. Од­нако если в результате эволюционной дивергенции последователь­ности нуклеотидных оснований геномов двух бактерий различа­ются в большей степени, то специфическая реассоциация ДНК— ДНК становится такой слабой, что не поддается измерению. В таком случае гибридизация ДНК—рРНК позволяет значительно увеличить круг организмов, у которых можно определить степень генетической гомологии благодаря тому, что на относительно не­большом участке бактериального генома, кодирующем рибосом-ные РНК, исходная последовательность оснований сохраняется значительно полнее, чем на других участках хромосомы. В итоге методом ДНК—рРНК гибридизации часто обнаруживают доволь­но высокую гомологию геномов бактерий, у которых реассоциация ДНК—ДНК не выявляет заметной гомологии.

Для идентификации бактерий иногда используют также метод ДНК-зондов (генных зондов), являющийся разновидностью мето­да молекулярной гибридизации ДНК—ДНК. Реакция гибридиза­ции ведется в этом случае не между двумя препаратами тоталь­ной ДНК» а между фрагментом нуклеотидной последовательно­сти ДНК (зондом), включающим ген (генетический маркер), от­ветственный за какую-то определенную функцию (например, ус­тойчивость к какому-нибудь антибиотику), и ДНК изучаемой бак­терии. Самым распространенным способом создания генных зон­дов является выделение специфических фрагментов путем моле­кулярного клонирования. Для этого вначале создают «банк ге­нов» изучаемой бактерии расщеплением ее ДНК эндонуклеазами рестрикции, а затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов ДНК методом электрофореза с последующей проверкой генетичес­ких свойств этих фрагментов методом трансформации. Далее вы­бранный фрагмент ДНК с помощью фермента лигазы вводят в состав подходящей плазмиды (вектора), а эту комбинированную плазмиду вводят в удобный для работы штамм бактерий (напри­мер, Escherichia coli). Из биомассы бактерии, несущей ДНК-зонд, выделяют плазмидную ДНК и метят ее, например, радиоизотопной меткой. Затем осуществляют гибридизацию ДНК зонда с ДНК бактерии. Образовавшиеся гибридные участки проявляют мето­дом ауторадиографии. По относительной частоте гибридизации ге­нетического маркера с хромосомой той или иной бактерии дела­ют заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуе­мым штаммом. однако наиболее широкое распространение и значение для идентификации бактерий и создания филогенетической системы их классификации получил метод анализа нуклеотидных последова­тельностей в рибосомальных РНК. Молекулы 5S, 16S и 23S рРНК содержат участки с самой высокой степенью генетической стабильности. Считают, что они находятся вне механизма дейст­вия естественного отбора и эволюционируют только в результате спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью. Так как накопление мутаций зависит только от времени, то информа­ция о нуклеотидной последовательности этих молекул является наиболее объективной для определения филогенетического родст­ва организмов на уровне от подвида до царства. В случае анали­за 5S рРНК обычно определяют полную последовательность нук­леотидных последовательностей, которая в этой молекуле у прока­риот составляет 120 нуклеотидов. При исследовании 16S и 23S рРНК, содержащих 1500 и 2500 нуклеотидов соответственно, час­то проводят анализ олигонуклеотидов, полученных из этих моле­кул с помощью специфических эндонуклеаз рестрикции. Наибо­лее широкое распространение получило изучение последователь­ности олиголуклеотидов в 16S рРНК. Изучение структуры 16S рРНК представителей разных бактерий привело к выявлению сре­ди прокариот группы архебактерий. Значения коэффициента сход­ства 5_Ав, отделяющие 16S рРНК эубактерий и архебактерий, ле­жат в пределах 0,1, в то время как значение Sab, равное 1,0, соот­ветствует полной гомологии нулеотидных последовательностей, а 0,02 — уровню случайного совпадения.

Все чаще для идентификации бактерий предлагают дендро-граммы, показывающие взаимоотношения между бактериальными родами, видами или штаммами на основании изучения последо­вательности нуклеотидов (или олигонуклеотидов) в рРНК, а так­же ДНК—ДНК и ДНК—рРНК гибридизации. Однако различия в темпе эволюции у разных групп организмов, а также трудоем­кость и дороговизна этих методов, не дают возможность использо­вать только филогенетический подход для систематики бактерий. Более того, идентификация бактерий до родов на основании толь­ко генетических методов без предварительного изучения их фено-типических характеристик часто вообще невозможна. Поэтому лучшим подходом в работе по систематике бактерий является изу­чение как генотипических, так и фенотипических свойств. В слу­чае несоответствия между филогенетическими и фенотипическими данными приоритет временно отдают последним.

Идентификацию бактерий проводят обычно с помощью опре­делителя Берги (Более полная информация о таксономическом положении бак­терий содержится в 4-томном Руководстве Берги по систематике бактерий (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1984— 1989). Для каждой группы бактерий дается описание входящих в него родов и видов, в том числе с неясным таксономическим ста­тусом.

Билет №17