Вопрос 3. Методы окраски мо

Клетки МО окрашивают главным об­разом анилиновыми красителями. Различают кислые и основные красители. К кислым красителям относятся (эозин, эритрозин, нигрозин, кислый фуксин);те, у которых ион-хромофор — анион. У основных красите­лей (метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристаллический фиоле­товый, сафранин) хромофор-катион. Различают простые и дифференциальные способы окрашива­ния микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а определенных ее структур. С помощью дифференциаль­ной окраски выявляют некоторые клеточные структуры и запас­ные вещества.

Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще все­го пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Фиксированный препарат помещают над кюветой, и заливают красителем на 1—3 мин. По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат вы­сушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного масла и просматривают.Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый филь­тровальной бумагой. Метод окрашивания Синева позволяет использовать вместо растворов красителей фильтро­вальную бумагу, заранее пропитанную красителем.

Окраска по Граму :на одном обез­жиренном стекле делают мазки разных МО:в цен­тре — мазок клеток исследуемой культуры, слева и справа — кон­трольных культур. Клетки одной контрольной культуры должны быть ГР+ (Micrococcus luteus, Bacillus cereus), другой—Гр- ( Escherichia coli). Кклетки равномерно распределялись по стеклу.Высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1—2 мин кристаллическим фиолетовым.Затем,не .промывая водой, обрабатывают 1—2 мин р-ом Люголя до почернения. Сливают раствор Люголя, препарат обесцвечивают 1мин спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают 1—2 мин водным фуксином. Краситель сливают, препарат промы­вают водой, высушивают и смотрят с иммерсионной сис­темой. Гр+ -сине-фиолетовые,Гр- — розово-крас­ные.

Билет №2

Вопрос1. Генетическаятрансформация: трансформация, конъюгация, трансдукция.

Рекомбина­ция-тип наследственной изменчивости, при которой происходит частичное объединение геномов двух клеток. Известны три способа, приводящих к ре­комбинации генетического мате­риала прокариот (конъюгация, трансформация и трансдукция), различающихся механизмами передачи хромосомной ДНК.

КОНЪЮГАЦИЯ-направленный пере­нос генетического материала от клетки-донора в клетку-реципи­ент при непосред­ственном контакте между бакте­риальными клетками. Как правило, в клетку-ре­ципиент переносится только часть генетического материала клетки-донора, в результате чего образуется неполная зигота, или мерозигота, содержащая часть генома донора и полный геном клетки-реципиента. Участки перенесенной от донора ДНК нахо­дят гомологичные участки в молекуле ДНК реципиента, между которыми происходит генетический обмен. В результа­те часть донорной ДНК встраивается в геном ре­ципиента, а соответствующая часть реципиентной ДНК из него исключается.

ТРАНСФОРМАЦИЯ-перенос ДНК, выделенной из одних клеток, в другие. Для трансформации не требуется непосредственного контакта между клетками. Спо­собность ДНК проникать в клетку-реципиент зависит от при­роды ДНК и от физиологического состояния клетки-реципиента. Трансформирующей ДНК могут быть только высоко­молекулярные двухцепочечные фрагменты, при этом проникать в бактериальную клетку может ДНК, выделенная из разных биоло­гических источников, но включаться в геном — только ДНК с определенной степенью гомологичности. После того как экзоген­ный фрагмент ДНК, проникший в клетку, нашел гомологичный фрагмент ДНК клетки-реципиента, между ними происходит ге­нетический обмен аналогично тому, как это имеет место на по­следнем этапе конъюгации.

ТРАНСДУКЦИЯ-перенос генов из одной бактериальной клетки в другую с помощью умеренных фагов. Трансдукция оказывается возможной, если в процессе размножения фага одна из частиц случайно захватит фрагмент бактериальной хромосомы, как правило, содержащий очень не­большое число генов. Когда такая фаговая частица заражает бак­терию-реципиент, бактериальная ДНК проникает в клетку таким же путем, как фаговая. Между трансдуцированной бактериальной ДНК и гомологичным участком бактериальной хромосомы может произойти обмен, и как следствие его возникают рекомбинанты, несущие небольшую часть генетического материала клетки-доно­ра. Передача признаков с помощью фагов показана для бактерий, принадлежащих к разным родам.

ПЕРЕДАЧА ПЛАЗМИДАМИ определенного типа, обладающих генами, обеспечивающими эту возможность. Такие плазмиды помимо переноса собственного генетического материала обеспечивают перенос хромосомных генов, плаз­мид, не обладающих способностью к самостоятельному перено­су, а также передачу транспозонов из плазмиды в хромосому или другую плазмиду.

Передача плазмидами создает огромные возможности для интенсив­ных генетических обменов между клетками различных бактерий. Плазмидам и другим нехромосомным генетическим элементам принадлежит основная роль в передаче генетической информа­ции «по горизонтали». ДНК плазмиды и бактериальной клетки не имеют одинаковых нуклеотидных по­следовательностей, т. е. не являются гомологичными, рекомбина­ция между ними происходит не по механизму обмена, а по меха­низму встраивания. Рекомбинации такого типа проис­ходят также с участием транспозонов и IS-элементов при их перемещении (транспозиции) в пределах хромосомы. Встраива­ние плазмид и мигрирующих элементов приво­дит к введению в хромосому дополнительного генетического ма­териала и может вызывать перестройку бактериального генома: нарушать целостность генов или регуляцию их функционирова­ния, т.е. вызывать мутации.