Вопрос3. Метод количественного учёта бактерий.

О росте МО в естественных субстратах или в пит.средах судят по кол-ву клеток или биомассе в единице объема. Методы определения этих показателей могут быть прямыми (подсчет клеток под микроскопом, взвешивание на весах) или косвенными. Косвенные методы-измере­ние параметров, величина которых зависит от количества или био­массы МО (число колоний, выросших после высева суспензии клеток на пит.среду, рассеяние или поглоще­ние суспензией клеток света, содержание в ней белка и др.). Вы­бор метода зависит от целей исследования, свойств пит.среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии МО. Методы, используемые для опреде­ления числа одноклет. мо, не приемлемы при подсчете многоклеточных(нитчатых, мицелиальных и др)форм. При оценке численности необходимо помнить, что мо часто в прикрепленном (адгезированном) состоянии или в виде микроколоний. Перед началом под­счета их нужно отделить от частиц субстрата и друг от друга (десорбировать). Выбор метода десорбции (механическое переме­шивание суспензии клеток, растирание, обработка ультразвуком, применение ПАВ и т. д.) определяется особенностями субстрата.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК:

1.Подсчет клеток МО под микроскопом, используя счетные камеры, капилляры Перфильева, препараты фиксированных и окрашенных клеток, приготовленные на пред­метных стеклах или мембранных фильтрах. Перечисленные методы позволяют определить общее количество клеток в единице объе­ма. (подсчитываются все клетки, как живые, так и мертвые). Ограничение большинства указанных методов — необходимость высоких концентраций клеток в единице субстр.

2.Подсчет в счетных камерах. Рекомендуется использовать для подсчета крупных объектов — дрожжей, однокл. водорослей, конидии грибов и некоторых крупных бактерий. Обычно используют камеру Горяева — Тома.Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или суспендированием в 0,5%-ном водном растворе формалина.

Число клеток подсчитывают с объективом 8Х или 40Х.

3.Подсчет клеток в капиллярах Перфильева. Они имеют прямоугольное сече­ние и по принципу подсчета аналогичны счетной камере. При по­гружении капилляра в субстрат он заполняет­ся в силу своих капиллярных свойств. Затем капилляр помещают на предметное стекло, заливают конец расплавленным парафи­ном и подсчитывают клетки, используя объективы 40 X, 90 X или фазово-контрастное устройство.

4.Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (ме­тод Виноградского—Брида). Метод широко используется для оп­ределения численности МО в различных естествен­ных субстратах — почве, загрязненных водах, молоке, в оптически непрозрачных питательных средах, содержащих нерастворимые в воде компоненты, например, крахмал, соевую муку. Преиму­щество метода-фиксированные ок­рашенные препараты хорошо сохраняются, поэтому подсчет мож­но проводить в удобное для исследователя время.

5.Подсчет клеток на мембранных фильтрах реко­мендуется использовать для определения численности в субстратах с низкой плотностью клеток. Фильтрование пробы определенного объема позволяет сконцен­трировать на поверхности фильтра содержащиеся в пробе мо. Затем их окрашивают и подсчитывают.

6.Определение числа мо высевом на питательные среды дает возможность определить только число жизнеспо­собных клеток в популяции. Поскольку сред, пригодных для роста всех мо, не существует, метод высева дает возмож­ность определить число мо, способных расти на среде данного состава, но не позволяет учесть те мо, которые не растут или растут крайне медленно.

7.Определение количества клеток высевом на плотные пита­тельные среды (чашечный метод Коха)-Вопрос.применя­ют для определения численности жизнеспособных клеток в раз­личных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая ко­лония является потомством одной клетки. Это позволяет на ос­новании числа колоний, выросших после посева на плотную пи­тательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты колич-го учета мо, проведенно­го методом Коха, часто выражают не в числе клеток, а в услов.един. -колониеобразующих единицах (КОЕ). Этапы: 1)приготовление разведений. Численность популяции мо обычно велика, поэтому для получения изоли­рованных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной во­де или 0,85%-ном растворе NаС1. Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды — это 1-е разведение, 10^-1. Полу­ченное разведение перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая и выпуская из пипетки нее взвесь. Таким же образом готовят и пос­ледующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции мо; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.

2)посев. Высевать суспензию можно поверхностным или глу­бинным способом. (1)Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную, чаще агаризованную, пит.среду в ряд стерильных чашек Петри по15—20 мл в каждую Чашки оставляют на горизонтальной поверхности для застывания. Затем на ее поверх­ность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех послед­них разведений, причем из каждого делают 2—4 параллельных высева.Для каждого разведения новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

(2)При глубинном посеве точно измеренный объем (0,1, 0,5или1,0 мл) исходной суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 48—50° агаризованную среду, тщательно перемешивают и выливают в чашку Петри.Среде дают застыть. В случае глубинного посева пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следую­щих образом. По 1 мл из соответствующего разведения перено­сят стерильной пипеткой в 2—4 стерильные чашки Петри. Затем заливают чашки 15-20 мл расплавленной 48—50° плотной средой и смешивают пит. среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на го­ризонт. поверхности до застывания.Затем крышками вниз в термостат или анаэростат(для анаэробов)

3)подсчет выросших колоний. Колонии мо в зависимости от скорости роста подсчитывают через 2—15 суток инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чПетри. Каждую просчитанную колонию отме­чают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом коли­честве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитыва­ют колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иног­да для подсчета колоний используют специальные полуавтомати­ческие счетчики.

Лучшее разведение-то, при высеве из кото­рого в чПетри вырастает от 30—50 до 100—150 колоний. Если меньше 10, то эти ре­зультаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число ко­лоний, выросший при высеве из разведения на одной чашке.

Количество клеток в1мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле

М — количество клеток в 1 мл; а — среднее число колоний при высеве разведения, из которого сделан высев; V — объем суспензии; 10" — коэффициент разведе­ний.

Определение количества клеток высевом в жидкие среды (ме­тод предельных разведений)-Вопрос.для подсчета мо, которые плохо или совсем не растут на плотных питательных средах. В пробирки с жидкой средой вносят строго измеренный объем из различных разведений исследуемого суб­страта. После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался или отсутствовал рост, рассчитывают по табл.Мак-Креди наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл исследуе­мого субстрата.Этапы: (1)приготовление разведений как и для чашечного метода.

(2)посев.(3) регистрация результатов. Сте­рильную среду, обеспечивающую рост мо, числен­ность которых хотят определить, предварительно разливают в пробирки (колбы) и стерилизуют. В пробирки (колбы) следует наливать одинаковый объем среды. Посев проводят из каждого разведения или из 4—5 последних, причем каждое разведение вы­севают в 3—5 параллельных ряда пробирок. Количество посевного ма­териала везде одинаково и, как правило,1 мл. Засеянные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблет­ся от 2 до 15 суток и зависит от скорости роста мо. После инкубации регистрируют рост мо, используя различные показатели: помут­нение среды, образование пленки, осадка, газа или накопление в среде определенных метаболитов.

Наиболее вероятное количество клеток в единице объема рас­считывают по таблице Мак-Креди. Для этого первона­чально составляют числовую характеристику, которая включает три цифры. Первая слева-число пробирок в том последнем разведении, при высеве из которого во всех засеянных пробирках был отмечен рост. Две следующие цифры-число пробирок, в которых отмечен рост мо при засеве их из двух последующих разведений. Затем по таблице на­ходят наиболее вероятное число мо, соответствую­щее данному значению числовой характеристики. Количество мо в 1 мл (1 г) исходного субстрата соответствует этому числу, умноженному на то разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОМАССЫ

1.взвешивание.для оценки роста мо в жидких питательных средах. Метод не может быть использован при культивировании на средах, в состав которых входят соединения, не растворимые в воде.Этапы: 1.Доведение массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значения. -фильтры, предварительно положенные в открытую чашку Петри, или центрифужные пробирки помещают в сушильный шкаф и высушивают в течение 1—2 ч при 80—85° и 90—100° соотв.Затем чПетри с фильтрами или центрифужные пробирки вынимают из сушильного шкафа и пе­реносят в эксикатор с безводным СаСl или конц.H₂SO₄. Эксикатор ставят около аналитических весов, на которых будет проводиться взвешива­ние. Через час фильтры (центрифужные пробирки) взвешивают с точностью до 0,0001 г.2.Отделение микроорганизмов от среды возможно центрифугированием или фильтрованием.