Вопрос1. Современные этапы в развитии микробиологии, его особенности.

Успехи микробиологии во второй половине XIX в. привели к обнаружению чрезвычайного разнообразия типов жизни в микро­мире. Следующий вопрос, заинтересовавший исследователей: как объяснить такое многообразие, определить его границы, выявить, на чем оно основано? Постановкой этой проблемы, имеющей общебиологическое значение, мы обязаны двум крупнейшим микробиологам нашего времени А.Клюйверу (A.Kluyver, 1888— 1956) и К. ван Нилю (С. van Niel, 1897—1985). АКлюйвер и его ученики (одним из них был К. ван Ниль) провели сравнительные биохимические исследования в относительно далеко отстоящих друг от друга физиологических группах микроорганизмов. Было изучено много форм микроорганизмов и примерно к середине 50-х гг. XX в. сформулировано то, что теперь называют теорией биохимического единства жизни.

В чем же конкретно состоит биохимическое единство жизни? Общее основано на единстве конструктивных, энергетических про­цессов и механизмов передачи генетической информации. А. Клюй-вер доказал два первых положения: все живые организмы постро­ены из однотипных химических макромолекул, универсальной единицей биологической энергии служит АТФ, в основе физио­логического разнообразия живых существ лежит несколько основ­ных метаболических путей. Что касается последнего положения, то сам А. Клюйвер изучением этой проблемы не занимался. Един­ство системы передачи генетической информации у всех клеточ­ных типов жизни было установлено позднее. В настоящее время мы пока не знаем исключений, которые ставили бы под сомне­ние теорию биохимического единства жизни.

С начала XX в. продолжается дальнейшая дифференциация мик­робиологии. От нее отпочковываются новые научные дисциплины (вирусология, микология) со своими объектами исследования, выделяются направления, различающиеся задачами исследования (общая микробиология, техническая, сельскохозяйственная, ме­дицинская, генетика микроорганизмов).

Вопрос 2. Непрерывные и синхронизированные структуры, способы их получения и назначения.

Существуют две принципиально разные системы выращивания микроорганизмов в жидкой среде. В одном случае после инокуля­ции среды не происходит ни добавления в нее, ни удаления ка­ких-либо компонентов, кроме газовой фазы. Такая закрытая сис­тема культивирования носит название периодической и может поддерживать размножение клеток только в течение ограниченно­го времени, на протяжении которого меняется состав исходной среды и окружающие условия.

Непрерывное (проточное) культивирование в отличие от пе­риодического характеризуется постоянной подачей питательной среды со скоростью, равной скорости удаления культуры. При этом объем культуры в ферментере во времени не меняется. Одно из основных условий непрерывного культивирования — хорошее перемешивание культуры в ферментере. Система непрерывного культивирования может быть реализована по принципу турбидо-стата или хемостата. Турбидостат — наиболее простой режим проточного культивирования, концентрация клеток в нем выбира­ется исследователем, а поступление питательных компонентов ав­томатически реализуется в соответствии с плотностью популяции. Меняя скорость подачи питательной среды («скорость разбавле­ния»), экспериментатор может получать разные значения скоро­сти роста популяции — от близких к нулю до максимальной, та­ким образом воспроизводя разные состояния культуры от стацио­нарной фазы до стадии .экспоненциального роста.

Для непрерывного культивирования микроорганизмов может быть использован слегка модифицированный ферментер, применя­емый при периодическом культивировании . В первом случае требуется система двойного насоса (для добавления свежей среды и удаления культуральной жидкости), используе­мая вместе с регулятором уровня среды; при этом культуральная жидкость удаляется через отверстия для отбора проб. Такие на­сосы необходимы при проточном культивировании в больших ем­костях. В малых ферментерах удаление жидкости может происходить

через боковую отводную трубку, расположенную на уровне, позволяющем поддерживать определенный объем культуры. Ма­лые ферментеры с боковым ОТВОДОМ ЖИДКОСТИ можно изготовить из стандартных стеклянных или стальных сосудов.

типичная кривая роста простой гомогенной периодической культуры бактерий. Рост проходит через лаг-фазу, в течение которой число клеток не увеличивается. Затем начинается фаза роста, которая обычно характеризуется экспоненциальным уве­личением количества клеток и подчиняется уравнениям (10.1) — (10.4). В конечном счете изменения химическо­го и физического состава среды приводят к переходу культуры в стационарную фазу, в которой увеличения количества клеток не происходит, но клетки еще нужда­ются в источниках энергии для поддержания своей жиз­недеятельности. Поскольку в периодической культуре питательные вещества ограниченны, наступает фаза от­мирания (автолиза), которая часто характеризуется экспоненциальным уменьшением количества жизнеспо­собных клеток.

Лаг-фазу можно вызвать путем быстрого изменения состава среды культивирования. В свежей среде дли­тельность лаг-фазы зависит от количества и возраста посевного материала, а также от изменений состава и концентрации питательных компонентов при внесении инокулята. Внесение небольшого инокулята в большой объем свежей среды может привести к диффузии из кле­ток витаминов, кофакторов и ионов, которые необходимы для поддержания активности многих внутриклеточных ферментов. Если клетки инокулируют из богатой среды в минимальную, то продолжительность лаг-фазы очень сильно зависит от объема инокулята, поскольку он со­держит микроэлементы, попадающие при инокуляции в ростовую среду.

Длительность лаг-фазы зависит и от возраста иноку­лята. Это связано с тем, что в клетках накапливаются токсичные вещества, но в них недостаточно питатель­ных веществ, необходимых для первоначального роста. Таким образом, наблюдается как положительный, так и отрицательный эффект возраста инокулята на продол­жительность лаг-фазы в свежей среде. Как правило, при переносе клеток из бедной среды в богатую с увеличе­нием возраста инокулята лаг-фаза удлиняется. На кри­вой зависимости продолжительности лаг-фазы от возрас­та инокулята при пересеве культуры с богатой среды на более бедную можно обнаружить определенный «минимальный» участок, отражающий обмен между питатель­ными веществами и внутриклеточными токсичными сое­динениями.

Наконец, изменения состава питательных компонен­тов, а также их концентраций при переносе инокулята на свежую среду могут действовать как триггер при ре­гуляции активности ферментов и морфологической диф-ференцировке клеток, например при прорастании спор. Если клетки переносят с бедной среды на богатую, то питательные компоненты и время расходуются на повы­шение активности ферментов, необходимых для осу­ществления метаболизма в целом. Если же клетки пере­носят с богатой среды на среду с более низким уровнем питательных веществ, то они способны немедленно, хотя и с низкой скоростью, вступить в экспоненциальную фазу роста.

Возможность постоянного экспоненциального роста в периодической культуре, хотя и в течение ограниченного времени, свидетельствует о том, что его скорость факти­чески не зависит от изменений концентрации субстратов в довольно широких пределах. В этом случае можно го­ворить о сбалансированном росте культуры (см. выше), который описывается только величиной ц. Со временем рост культуры начинает отклоняться от экспоненциаль­ного, и его уже нельзя описывать только с помощью одной величины ц, даже если можно рассчитать эту ве­личину для случая лимитирования субстратом [уравне­ние (10.5)]. Моно [44] следующим образом описал со­отношение между концентрацией субстрата и ростом бактерий в простой системе, находящейся в экспонен­циальной фазе:

где ц — удельная скорость роста, |i_max— максимальное значение (л, полученное при S^>Ks> Ks — константа на­сыщения, эквивалентная константе Михаэлиса — Ментен, a S — концентрация субстрата во время экспоненциаль­ной фазы роста.

Для описания зависимости роста культур от кон­центрации субстрата существует несколько альтернатив­ных моделей [44]. Уравнение (10.5) можно использовать робно понятие экономического коэффициента обсужда­ется ниже в этой же главе (разд. 10.5). Чтобы предска­зать время достижения максимальной плотности биомас­сы в периодической культуре, необходимо сделать ряд упрощающих допущений [2, 4].

В периодической культуре максимальную биомассу определяют из экспериментальных данных, исходя из отношения прироста массы клеток к соответствующему снижению концентрации субстрата:)

где х и S — соответственно концентрации клеток и суб­страта в момент времени /, Хо и S₀ — концентрации кле­ток и субстрата в более раннее время /₀, а У — коэффи­циент общего выхода (экономический коэффициент). Уравнение точно описывает соотношение между концентрациями клеток и субстрата во время экспонен­циальной фазы роста. Если экспоненциальный рост про­должается с постоянной скоростью вплоть до достиже­ния стационарной фазы, а субстрат полностью исчерпы­вается во время экспоненциального роста, то с помощью уравнения (10.6) можно рассчитать максимальное число клеток или их концентрацию. Этот расчет верен при ус­ловии, что экономический коэффициент остается на по­стоянном уровне в течение всего цикла роста и потреб­лением субстрата в течение лаг-фазы можно пренебречь. На самом деле экономический коэффициент остается по­стоянным лишь при условии постоянного экспоненциаль­ного роста с одной удельной скоростью. Отсюда следует, что предсказанная с помощью уравнения (10.6) величи­на максимальной биомассы явно завышена.