Вопрос 3. Метод Коха.

Метод широко применя­ют для определения численности жизнеспособных клеток в раз­личных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая ко­лония является потомством одной клетки. Это позволяет на ос­новании числа колоний, выросших после посева на плотную пи­тательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного учета микроорганизмов, проведенно­го методом Коха, часто выражают не в числе клеток, а в услов­ных единицах — так называемых колониеобразующих единицах (КОЕ). Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.

Приготовление разведений. Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изоли­рованных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной во­де или 0,85%-ном растворе физрастворе. В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведе­ния, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.

Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды — это 1-е разведение, 10^-1. Полу­ченное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3—5 раз, затем той же пипеткой отби­рают 1 мл полученной суспензии и переносят во 2-ю пробирку — получают 2-е разведение (10~²). Таким же образом готовят и пос­ледующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.

Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом при­водит к получению ошибочного результата.

Посев. Высевать суспензию можно поверхностным или глу­бинным способом. Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную, чаще всего агаризованную, питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15—20 мл в каждую Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, по­ка среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед по­севом рекомендуется подсушивать для удаления конденсацион­ной воды.

Среду можно подсушить, поместив чашки в термостат на 2—3 суток крышками вниз. После того как среда готова, на ее поверх­ность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех послед­них разведений, причем из каждого делают 2—4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начи­нать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило 0,1, 0,5 или 1,0 мл) исходной суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 48—50° агаризованную среду, тщательно перемешивают и затем немедленно выливают в чашку Петри Среде дают застыть. В случае глубинного посева пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следую­щих образом. По 1 мл из соответствующего разведения перено­сят стерильной пипеткой в 2—4 стерильные чашки Петри. Затем заливают чашки 15—20 мл расплавленной и остуженной до 48—50° плотной средой и тщательно смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на го­ризонтальной поверхности до застывания. Когда среда застынет, чашки Петри в перевернутом виде помещают в термостат.

Для определения количества клеток анаэробных микроорга­низмов чашки Петри с плотной средой после посева помещают в анаэростаты. Иногда для определения численности анаэробов плотную среду после засева оставляют в пробирках. Поверхность застывшей среды заливают парафином. Для лучшего рассмотре­ния колоний микроорганизмов среды в этом случае рекомендует­ся осветлять. Определение численности экстремальных анаэробов требует применения техники Хангейта.

Подсчет выросших колоний. Колонии микроорганиз­мов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 2—15 суток инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отме­чают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом коли­честве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитыва­ют колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иног­да для подсчета колоний используют специальные полуавтомати­ческие счетчики.

Лучшим разведением следует считать то, при высеве из кото­рого в чашке Петри вырастает от 30—50 до 100—150 колоний. Если число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти ре­зультаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число ко­лоний, выросший при высеве из разведения на одной чашке.

Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле

где М — количество клеток в 1 мл; а — среднее число колоний при высеве разведения, из которого сделан высев; V — объем суспензии, взятый для посева, в мл; 10" — коэффициент разведе­ний.

Билет №11