Вопрос 2. Закономерности роста популяции в период(стационар)культуры.Кривая и фазы роста.

При внесении бактерий в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых компонентов среды не достигнет min , после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не уда­лять конечных продуктов обмена, то получим -периоди­ческую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном про­странстве).

Периодическая культура ведет себя как многоклеточный организм с генетически ограниченным ростом.

Кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени, называется-кривой роста.

ФАЗЫ: 1)начальную (или лаг-) фазу,2) экс­поненциальную (логарифмическую) фазу, 3)стационарная фаза,4)фа­за отмирания.

1)Начальная(лаг) фаза адаптации- промежуток времени между инокуляцией и достижением max скорости деления. Продол­жительность зависит от предшествовавших условий культивирования ,возраста инокулята,и от того, на­сколько пригодна для роста данная среда. Количественное изменение состава бактериальной клетки во время начальной фазы роста сильнее всего затрагивает РНК: содержание РНК повышается в 8-12 раз. Это указывает на уча­стие РНК и рибосом в синтезе ферментных белков.

2)Экспоненциальная(логарифмическая)фаза-постоянная max скоростью деления. Скорость зависит от вида бактерий,и от среды. Величина клеток и содержание в них белка у многих бактерий тоже остаются в экспоненциальной фазе постоянными.Можно сказать, что бактериальная культура в этом случае состоит из «стандартных клеток». Нередко, клетки периоди­ческой культуры претерпевают изменения, так как постепенно изменяет­ся среда: уменьшается концентрация субстрата, увеличивается плот­ность клеточной суспензии и накапливаются продукты обмена.МО здесь самые уязвимые.

3)Стационарная фаза-наступает, когда число клеток перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентра­ции субстрата. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Ско­рость роста снижается из-за нехватки субстрата,из-за большой плотности популяции,из-за низко­го парциального давления 0₂ или накопления токсичных продуктов об­мена; все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе.Могут еще происходить использо­вание запасных веществ, распад части рибосом и синтез ферментов. Урожай(выход)-количество биомассы, достигнутое в стационарной фазе.

4)Фаза отмирания. Фаза отмирания и причины гибели бактериальных клеток в нормальных питательных средах изучены недостаточно. Срав­нительно легко понять случаи, когда в среде накапливаются кислоты (при росте Escherichia, Lactobacillus). Число живых клеток может сни­жаться экспоненциально. Иногда клетки лизируются под действием соб­ственных ферментов.

Вопрос 3. Методы получения чистой кльтуры

А-Выделение чистой культуры из отдельной колонии

Это основной метод выделения чистых культур мо, предложенный Р. Кохом. Принцип- получение чистой культуры из отдельной колонии. Однако этот метод неприменим для выделения мо, которые не растут или плохо растут на плотных средах(некоторые бактерии, многие водоросли и простейшие).

При выделении чистой культуры аэробов накопительную культуру высевают на поверхность плотной среды. Порядок работы следующий. Расплавленную на кипящей водяной бане стерильную питательную среду, содержащую агар или жела­тину, разливают в стерильные чашки Петри. Когда сре­да застынет, на ее поверхность из пипетки наносят каплю нако­пительной культуры или ее разведения в стерильной воде и сте­рильным стеклянным шпателем Дригальского распределяют кап­лю сначала по одной половине поверхности среды в чашке Петри,затем по второй половине, после чего этим же шпателем протира­ют поверхность плотной среды последовательно во 2-й, 3-й и 4-й чашках. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюда­ют сплошной рост мо,а в последующих — изолированные колонии. Рассевать накопительную к­-ру можно петлей методом истощающего штриха. В этом случае накопительную к-ру или ее разведение отбирают петлей и на поверхности .плотной среды проводят штрихи в таком порядке, как указано на рис. Перед каждым новым штрихом петлю стери­лизуют в пламени горелки.

После посева чашки помещают в термостат крышками вниз,чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки Петри при застывании агара, не помешала получить изолирован­ные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1—7 суток в зависимости от скорости роста мо. Выросшие изолированные колонии отсевают петлей на поверхность ско­шенной плотной среды в пробирки или в жидкую среду.

И золированные колонии аэротолерантных мо и факультативных анаэробов чаще получают методом глубинного досева. Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по 15—20 мл и стерилизуют. Непосредст­венно перед посевом пробирки помещают в кипящую водяную ба­ню, чтобы среда расплавилась. Высев проводят из разведений на­коп-ой к-ры в стерильной водопроводной воде. Разведе­ния готовят с таким расчетом, чтобы при высеве 0,5—1,0 мл раз­ведения получить изолированные колонии. Степень разведения оп­ределяется плотностью на­коп-ой к-ры. Высевы делают, как правило, из 3-4х последних разведений. Для этого в пробирку с расплавленной и остуженной до 48—50°агаризованной средой вносят 0,5—1,0 мл одного из разведений накопительной культуры. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями. Затем около пламени горелки выни­мают из пробирки пробку, обжигая края пробирки в пламени го­релки, и быстро выливают содержимое пробирки в чашку Петри. После того как агаризованная среда застынет, чашки Петри по­мещают в термостат. Колонии, выросшие в толще среды, выреза­ют стерильным скальпелем или извлекают стерильными капил­лярными трубками или просто петлей и переносят в жидкую сре­ду.

Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев проводят на по­верхность среды в чашки Петри, но после посева чашки тотчас помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом раз­ведения-разведения накоп-ой к-ры проводят в расплавленной и охлажденной до 45—50° агаризованной питательной среде. Делают 6—10 последо­вательных разведений. Затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла (3:1), что препятствует про­никновению воздуха в толщу агаризованной среды.

Иногда агаризаванную питательную среду после посева и тща­тельного перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри. Можно использовать капиллярные пипетки Пастера, в которые набирают соответствующее разведение накопительной культуры в расплавленной агаризованной питательной среде. Конец капилля­ра запаивают. При удачно выбранном разведении накопительной культуры в одной из пробирок (пипеток Пастера, трубок Бурри) вырастают изолированные колонии. Извлечение образовавшихся колоний- а)удаляют стериль­ной иглой слой парафина и вазелинового масла, а столбик агаризованной среды выдувают из пробирки в стериль­ную чашку Петри, пропуская газ, не содержащий кислорода, че­рез капилляр, который помещают между стенкой пробирки и агаризованной средой. Агаризованную среду из трубки Буррл выду­вают, пропуская газ через ватную пробку.

б)робир­ку слегка нагревают, все время быстро вращая ее над пламенем горелки. При этом агар, непосредственно прилегающий к стенке, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика лег­ко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара раз­резают стерильным ланцетом и извлекают колонии, захватывая их стерильными капиллярными трубками или петлей. Можно также вырезать их стерильным ланцетом. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщательной дезинфекции поверхности его разламывают стерильным пинцетом и уча­стки капилляра, содержащие изолированные колонии, переносят в стерильную среду.

Для получения изолированных колоний ме­тодом глубинного посева и методом разведений рекомендуется использовать осветленные пита­тельные среды.

Получение изолированных колоний анаэробов,- исполь­зуют метод вращающихся пробирок Хангейта. (сущность)- расплавленную агаризованную среду за­севают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку. Агаризованная среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя агаризованной среды в пробирке, заполненной газовой смесью, позволя­ет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

Чаще посев в плотную питательную среду повторяют 2—3 раза.

Б-Выделение чистой культуры из одной клетки

Капельный метод Линднера -с помощью микроманипулятора или микроселектора.Используют при работе с дрожжами, мицелиальными грибами, во­дорослями. Порядок работы . Накопительную культуру разводят в стерильной среде с таким расчетом, чтобы в неболь­шой капле были одиночные клетки мо. Затем на поверхность стерильного покровного стекла стерильным стальным пером наносят ряд капель приготовленного разведения. Готовят препарат «висячая капля». Нанесенные на покровное стекло кап­ли просматривают под микроскопом и отмечают те, в которых об­наружена только одна клетка. После этого препарат помещают в термостат во влажную камеру, которой обычно служит чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне. Через 12—24 ч отмеченные капли вновь микроскопируют. Те, в. которых наблюдается образование микроколоний,сни­мают с покровного стекла кусочками стерильной фильтровальной бумаги и переносят в пробирки со стерильной средой.

Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора Пер­фильева -Микроманипулятор — прибор, позволяющий с помощью специ­альной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. Микро­манипулятор имеет два операционных штатива, между которыми расположен обычный микроскоп. На предметном столике микро­скопа установлена влажная камера, в которую помещают препа­рат «висячая капля». В держателях операционных штативов за­креплены микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Микропипетки вводят во влажную камеру так, чтобы их концы оказались в ви­сячей капле. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает от­дельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСТОТЫ ВЫДЕЛЕННОЙ КУЛЬТУРЫ

визуальным, микроскопическим контролем и высевом на ряд питательных сред. а)визуальный контроль -просматри­вается рост мо по штриху на поверхности скошен­ной агаризованной среды. Если рост по штриху неоднороден, куль­тура загрязнена. Такой контроль возможен только для культур, способных расти на поверхности плотных сред.

б)под микроскопом-готовят препа­рат фиксированных окрашенных клеток и смотрят его с им­мерсионной системой или препарат живых клеток и смотрят его, используя фазово-контрастное устройство.в)высев на питательные среды-выделенную культуру высевают на питательную среду, благоприятную для ее роста. Однородность выросших колоний — свидетельство чистоты культуры. Обязателен посев на мясопептонный агар. Критерием чистоты-однородность выросших колоний или отсутствие роста, если данные мо на МПА не развиваются.

Билет №7