Вопрос 3. Назначение и методы фиксации мб препаратов

Назначение: 1)убить МО, т. е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ни­ми;2) обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу;3)сделать ма­зок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки ок­рашиваются лучше, чем живые.Методы:1) термическая обработка- препа­рат трижды проводят через наиболее горячую часть пла­мени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. 2)для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации химическими вещест­вами. Фиксирующую жидкость(96⁰этиловый спирт;метиловый спирт;смесьНикифорова;фосфорномолибденовая к-та) наливают на ма­зок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксатором.

Билет №6

Вопрос 1. Строение и ф-ии клет.Стенки,хим.Состав и выявление

Кл.стенка — важный и обязательный структурный эле­мент большинства прокариот, распола­гающийся под капсулой или слизистым чехлом или контактирующий с окруж.средой.На долю клеточной стенки приходится от 5 до 50 % сухих веществ клетки. В ее состав входят специфические полимерные комплексы, которые не содержатся в других клеточных структурах. Хим.состав и строение кл.ст. постоянны для определенного вида и являются диагностическим признаком. В зависимости от строения кл.ст. прокариоты, относящиеся к эубактериям, делятся на две большие группы:Гр+ и Гр- У неко­торых эубактерий положительная реакция при окрашивании опи­санным выше способом свойственна только клеткам, находящимся в стадии активного роста.

В состав клеточной стенки эубактерий входят 7 групп химических веществ, при этом пептидогликан присутству­ет только в кл.ст. У Гр+эубактерий он составляет 40-90 %,основной массы вещества клеточной стенки.У Гр-1 —10 %. Толщина Кл.стенки-20-80 нм. У Гр- обнаружена многослой­ная кл.ст. внутренний слой-электронно-плотный тол­щиной 2—3 нм состоит из пептидогликана. Наружный- 8—10 нм волнистый прилегает к внутр.слою, Имеет строение: две электронно-плотные полосы, раз­деленные электронно-прозрачным промежутком.Кл.ст. Гр+плотно при­легает к ЦПМ.У Гр-пептидогликан и наруж­ная мембрана разделены электронно-прозрачным промежутком и четко отделены от ЦПМ. Периплазматическое пространство-простр-во между ЦПМ и наружной мембранами.

I-клеточная стенка Гр+. В неё входят:1)Основную массу кл.ст. состав­ляет специфический гетерополимер — пептидогликан. Полисахаридный остов молекулы построен из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных 3-1,4-гликозидными связями. К N-ацетилмурамовой кислоте присоединены4-5 а/к.Обнаружено более 100 раз­личных химических типов пептидогликана. Большинство разли­чий относится к пептидной части его молекулы.

Особенности: наличие D-аминокислот и высокое содержание основных а/к. Обе аминогруппы этих аминокислот могут участвовать в образовании пептидных связей.В образовании пептидной связи участвует -СООНгруппа D-аланина одного тетрапептида и свободная NH₂-группа диаминопимелиновой кислоты другого.2)тейхоевые кислоты-по­лимеры на основе рибита (5) или глицерина (3), остатки которых соедине­ны между собой фосфодиэфирными связями. Некоторые замещены остатками D-аланина, глюкозы, N-ацетилглюкозамина и некоторых других сахаров. Тейхоевые кислоты ковалентно могут соединяться с N-ацетилмурамовой кислотой.Тейхоевые кисл. пронизывают весь пептидогликан, достигая внешней поверхности кл.ст.-основные АГ. Кл.ст. Гр+-это губчатая структуры с порами диаметром 1—6 нм. Возможность про­хождения молекул через такую клеточную стенку определяет­ся ее зарядом и размером пор.

II-Клеточная стенка Гр-. на­много сложнее, чем у Гр+. 1)1-2 слоя пептидогликана образуют внутренний слой кл.ст., неплотно прилегая к ЦПМ. Имеет редкие по­перечными связями между гетерополимерными цепями.

2)Снаружи от пеп­тидогликана-наружная мембрана. Она состоит из фосфолипидов,белков, липопротеина и липополисахарида. Липополисахарид-спе­цифический компонент наружной мембраны.око­ло 30—40 % ее поверхности и локализованный в наружном монослое.

Белки наружной мембраны:а)основные-80 % всех белков наружной мембраны Функция- формирование гидрофильных пор диаметром1 нм, через кото­рые осуществляется диффузия молекул. и б)минорные -большое числом видов.Функция — транспортная и рецепторная. Порины-белки, пронизывающие наружную мембрану насквозь и образующие поры.

III-необычные клеточные стенки. Некоторые скользящие бактерии (миксобактерии, флексибактерии) способны при перемещении по твердому субстрату менять форму клеток, например путем изгибания, что говорит об эластичности их клеточной стенки и в первую очередь ее пептидогликанового слоя. Вероятное объяснение гибкости кл.ст. этих бактерий — чрезвычайно низкая сшитость ее пепти­догликанового компонента.

У архебактерий есть существенные отличия в строениикл.ст.Клеточные стенки метанобразующих архебактерий содержат пеп­тидогликан особого химического строения. У других представи­телей этой группы клеточная стенка состоит исключительно из кислого гетерополисахарида, а у некоторых экстремально галофильных, метанобразующих и ацидотермофильных архебактерий — только из белка.

III-прокариоты без кл.ст. При действии хим.вещ можно получать формы с частично (сферопласты) или полностью (протопласты) отсутствующей кл.ст. Впервые это обнаружили при действии лизоцима, ферментом из группы гликозидаз, в яичном белке, слезной жидкости. Лизоцим разрывает связи в остове,что может привести к полному удалению пептидогликана. Полученные под действием лизоцима сферопласты или протопласты принимают сферическую форму и очень чувствительны к внешнему осмотическому давлению. Существо­вать они могут только в условиях, когда осмотическое давление питательной среды сбалансировано с осмотическим давлением внутри клетки. В благоприятных условиях сферопласты и прото­пласты проявляют определенную метаболическую активность, но утрачивают способность к размножению.

Микоплазмы- прокариоты, не содержащие кл.ст.,изначально. Это группа, сапрофитов и внутриклеточ­ных паразитов растений, животных и человека. Формы, сходные с микоплазмами, были получены также опытным путем с по­мощью пенициллина, лизоцима и других факторов. Это L-формы. В благоприятных условиях они обладают метаболической активностью и способностью к размножению. Предполагают, что микоплазмы произошли в результате мута­ции синтеза Кл.ст.,L-формы получают экспериментально.

Пенициллин ингибирует образование связей между пептидными хвостами на этапе «сшивания» полимера, происходящего в кл.ст. в процессе роста.

Функции клеточной стенки.1)механически защищает клетку от воздействий окр.среды.2)поддер­живает внешнюю форму клетки.3)регуляция роста и деления.4)коммуникация через каналы и поры.5)несет рецепторы к фагам.6)определяет антигенную хар-ку клетки.7)иммунологические св-ва благодаря пептидогликану..8)L-трансформация из-за нарушения синтеза кл.ст.Периплазматическое пространство заполнено раствором, в состав которого входят специфические белки(транс­портные и гидролитическими ферментами, гликозидазы, протеазы, липазы), олигосахариды и неорганические молеку­лы.Прокариоты нуждаются в гидролитиче­ских ферментах, т.к. это расширяет круг используемых веществ.Гр+ выделяют гидролитические ферменты во внешнюю среду, у Гр- они локализованы в периплазматическом пространстве.

Окраска по Граму :на одном обез­жиренном стекле делают мазки разных МО:в цен­тре — мазок клеток исследуемой культуры, слева и справа — кон­трольных культур. Клетки одной контрольной культуры должны быть ГР+ (Micrococcus luteus, Bacillus cereus), другой—Гр- ( Escherichia coli). Кклетки равномерно распределялись по стеклу.Высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1—2 мин кристаллическим фиолетовым.Затем,не .промывая водой, обрабатывают 1—2 мин р-ом Люголя до почернения. Сливают раствор Люголя, препарат обесцвечивают 1мин спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают 1—2 мин водным фуксином. Краситель сливают, препарат промы­вают водой, высушивают и смотрят с иммерсионной сис­темой. Гр+ -сине-фиолетовые,Гр- — розово-крас­ные.Сществуют и др.способы выявления Кл.ст.