Глава 6 Клеточная селекция

Одним из основных методов селекции микроорганизмов является отбор, проводимый на питательной среде, содержащей какой-либо селективный агент, либо в условиях действия селективных факторов внешней среды, например, пониженных или повышенных температур. Таким образом достаточно просто отобрать, например, мутанты, устойчивые к отдельным антибиотикам, токсинам, осмотическим стрессам. Культура клеток растений во многом напоминает культуру микроорганизмов. В связи с этим было естественным применение к растениям методов, хорошо зарекомендовавших в селекции микроорганизмов. Отбирая в культуре in vitro мутантные клеточные линии, устойчивые к определенным селективным агентам или факторам среды, можно, в принципе, получить растения-регенеранты, обладающие соответствующими признаками, имеющими хозяйственное значение.

Отбор мутантов на клеточном уровне, безусловно, имеет преимущество по сравнению с аналогичным отбором, проводимым на уровне организменном. В культуральном сосуде содержится огромное количество клеток, среди которых несложно отобрать обладающие нужными свойствами мутантные клетки, получить из них клеточную линию, из которой регенерировать растение.

Как видно из содержания предыдущих глав, культивируемые клетки не всегда воспроизводят свойства растений, из которых получили культуру. Соответственно, у растений-регенерантов могут не проявляться признаки, характерные для исходных клеточных культур. Тем не менее, как показала практика, имеется ряд направлений клеточной селекции, позволяющих получать растения-регенеранты с хозяйственно важными признаками: устойчивостью к гербицидам, к стрессовым факторам, некоторым заболеваниям, обладающих сверхпродукцией незаменимых аминокислот.

Клеточная селекция представляет интерес не только в связи с получением мутантных растений. Как отмечалось в главе 4, важное направление биотехнологии растений – производство вторичных метаболитов в культуре клеток, основано, среди прочего, на отборе клеточных линий, обладающих повышенной продукцией хозяйственно ценных веществ. Знание закономерностей и методических подходов клеточной селекции необходимо для повышения эффективности отбора линий-суперпродуцентов ВМ.

6.1 Гетерогенность и генетическая изменчивость клеток в культуре in vitro как основа клеточной селекции. Сомаклональная изменчивость.

Любая селекция может быть эффективной только в случае, если имеет место генетическая изменчивость селекционного материала (гибридов, линий, клеток). Долгое время считалось, что культивируемые клетки растений имеют генотип исходного растения, который они могут сохранять длительное время. Случаи появления измененных форм среди растений-регенерантов игнорировались или объяснялись физиологическими отклонениями, которые носят ненаследуемый характер.

В работах Gautheret (1955), Nobecourt (1955) была отмечена цитологическая нестабильность клеток при их длительном культивировании in vitro. Позднее появились публикации, в которых были описаны растения-регенеранты с различными нарушениями хромосомного состава [Murashige, Nakano, 1966; Бутенко и др., 1967], а также обладающие новыми хозяйственно ценными признаками, способными сохраняться в течение длительного времени [Heinz and Mee, 1971]. Это привело к мысли, что прохождение клетками стадии неорганизованного роста в условиях in vitro может сопровождаться существенными изменениями их генотипа, которые могут проявляться на уровне растений, регенерированных из таких измененных клеток. Явление изменчивости клеточных линий и растений-регенерантов получило название сомаклональная вариабельность (изменчивость) [Larkin and Scowcroft, 1981].

Различают два основных источника возникновения сомаклональных вариантов: генетическая гетерогенность клеток эксплантата и генетическая изменчивость, возникшая в процессе культивирования клеток in vitro.

Относительно высокая генетическая стабильность характерна лишь для меристемных клеток взрослого растения (см. гл. 5). Цитогенетическая стабильность клеток специализированных тканей не такая высокая. В частности, у многих видов растений клетки коры и сердцевины стебля являются полиплоидными (явление полиплоидизации соматических клеток называется полисоматия). Другой тип хромосомной вариабельности, характерной для соматических клеток растений, например, межвидовых гибридов, искусственно полученных автополиплоидов, – анеусоматия, то есть, присутствие анеуплоидных клеток.

Длительно размножаемые вегетативным способом растения могут накапливать точковые мутации соматических клеток, в результате чего они становятся химерными. Известны сорта и породы вегетативно размножаемых растений (картофеля, декоративных луковичных, древесных культур), а также мутанты, полученные на их основе, которые успешно выращивают в течение многих десятков лет. Например, широко выращиваемый в Америке сорт картофеля Russet Burbank, зарегистрированный в США в 1914 г., является спортом (клоном от почковой мутации) сорта Burbank, выпущенного на рынок в 1876 г. Естественно предположить, что чем более длительное время возделывают какой-либо сорт, породу, тем больше измененных клеток он содержит.

Некоторые из соматических мутаций легко обнаружить, например, у пестролистных декоративных растений. В большинстве же случаев полисоматия, анеусоматия и химеризм никак не проявляются. Однако при получении культуры клеток из эксплантатов, содержащих измененные клетки, возможна их дедифференциация, приобретение ими способности к делению, вторичная дифференциация, приводящая к регенерации измененных растений.

Изменчивость клеток может возникать и в процессе их культивирования in vitro. Условия существования клеток в составе интактного растения и при культивировании на агаризованной питательной среде или в виде клеточной суспензии существенно различаются. На уровне растения действует выработанная в процессе эволюции и приспособленная к определенным условиям окружающей среды система гомеостаза, в которой каждая группа клеток организма выполняет в процессе онтогенеза определенные функции. При этом все клетки связаны между собой коррелятивными отношениями, их изменчивость возможна в пределах нормы реакции, характерной для данного организма. Наиболее стабильны в генетическом отношении клетки генеративных органов и меристем, что обеспечивает возможность воспроизведения генотипа растения при размножении (половом и вегетативном).

Питание клеток и их гормональный статус в культуре in vitro существенно отличаются от такового у клеток интактного растения. В питательной среде нередко содержатся синтетические регуляторы роста растений, которые имеют выраженный мутагенный эффект. В частности, имеется много публикаций, в которых отмечено существенное влияние 2,4-Д на изменчивость культивируемых клеток растений. Некоторые из авторов рассматривают этот ауксин в качестве непосредственного индуктора полиплоидизации клеток или фактора, селективно стимулирующего деления полиплоидных клеток. Помимо регуляторов роста, на цитогенетическое разнообразие клеток в культуре in vitro могут оказывать влияние и другие компоненты питательной среды, например, различные источники азотного питания (органический, неорганический). Длительное пассирование культур способствует повышению генетического разнообразия клеток и растений-регенерантов.

В качестве возможных генетических механизмов возникновения сомаклональных вариантов рассматривают следующие (Karp and Bright, 1985):

- грубые кариологические изменения (полиплоидию и анеуплоидию, крупные перестройки хромосом);

- криптические, незаметные при цитологическом анализе, хромосомные перестройки (мелкие делеции, дупликации, транслокации, инверсии);

- точковые мутации;

- перемещения мобильных генетических элементов;

- амплификацию и редукцию генов;

- митотический кроссинговер.

Кроме сомаклональной вариабельности, связанной с наследуемыми перестройками генома, могут иметь место и эпигенетические изменения, которые стабильно передаются дочерним клеткам, но не проявляются у растений-регенерантов или у их полового потомства. Классический генетический анализ наследования каких-либо новых признаков, обнаруженных у растений-регенерантов и отсутствующих у исходных растений, позволяет сделать окончательное заключение, являются ли эти признаки результатом какой-либо мутации, либо ненаследуемым отклонением в физиологии растения.

Результаты генетических исследований на растениях разных видов убедительно доказывают, что большая часть сомаклональных вариаций обусловлена стабильными генетическими изменениями, то есть мутациями. Частота спонтанных мутаций при культивировании клеток растений варьирует в зависимости от объекта в пределах 10^-5 – 10^-8 [Сидоров 1990]. В качестве примера сомаклональной вариации можно привести результаты, полученные при изучении растений-регенерантов томатов (см. Сидоров, 1990):

- у сомаклонов различных сортов обнаружено несколько одиночных генных мутаций, наследуемых в соответствии с законами Менделя;

- идентифицированы доминантные, семидоминантные и рецессивные ядерные мутации;

- показано, что растения-регенеранты с одиночными генными мутациями могут возникать с высокой частотой: один мутант на 20-25 растений-регенерантов;

- среди сомаклонов выявлены новые мутации, которые не встречались среди спонтанных мутантов, или полученных с помощью традиционных мутагенов;

- получены экспериментальные данные, доказывающие, что одной из причин сомаклональной изменчивости может быть митотический кроссинговер;

- у сомаклонов обнаружены мутации хлоропластной ДНК.

Следует отметить, что в литературе накоплен большой объем фактов по сомаклональной вариации, связанной не только с изменчивостью генома, но и плазмона. Довольно частое явление – регенерация альбиносных растений с нарушенной структурой хлоропластного генома. Особенно много таких растений получают в культуре пыльников злаковых (подробнее этот вопрос будет рассмотрен в главе 7). Получены экспериментальные данные, показывающие изменчивость и митохондриального генома у растений- регенерантов. Так, Генгенбах с сотр. (Gengenbach et al. 1977) отобрали мужски фертильные сомаклоны среди растений-регенерантов, полученных из каллюсной культуры мужски стерильных линий кукурузы (с Т-цитоплазмой). При этом в отличие от исходных линий они обладали также устойчивостью к южному гельминтоспориозу кукурузы (возбудитель – Helmintosporium mayidis). Молекулярно-генетический анализ показал, что мужская фертильность и устойчивость к заболеванию не связаны у них с реверсией цитоплазмы от Т-типа к нормальному, а обусловлены определенными изменениями митохондриального генома Т-цитоплазмы, которые привели к появлению фертильных и устойчивых сомаклонов.

Уже в ранних исследованиях по сомаклональной изменчивости была показана возможность отбора среди растений-регенерантов мутантов с новыми признаками, имеющими важное хозяйственное значение. Heinz и Mee (1971) на Гавайях и их коллеги на Фиджи (Krishnamurthi, Tlaskal, 1974) выделили среди растений-регенерантов сахарного тростника сомаклоны с повышенной продуктивностью, устойчивые к вирусам, гельминтоспориозу, ложной мучнистой росе. Появление работ этих авторов фактически положило начало широкому развитию нового направления в селекции растений, основанного на отборе сомаклонов с улучшенными хозяйственно-ценными признаками. Интересные результаты были получены для ряда продовольственных, кормовых, технических, декоративных и лекарственных культур.

Шепард с сотр. (Shepard et al. 1980; Secor, Shepard, 1981) выделили ряд ценных сомаклональных вариантов среди растений-регенерантов, полученных в культуре протопластов картофеля сорта Russet Burbank: с повышенной продуктивностью, устойчивых к альтернариозу, фитофторозу. Эти признаки сохраняли стабильность в течение четырех лет вегетативного размножения. Сидоров с сотр. (1984, 1985) отобрали среди протоклонов сорта Зарево мутанты, отличающиеся высокой урожайностью, повышенной устойчивостью к заболеваниям, более высоким содержанием в клубнях протеина и крахмала. Имеется ряд сообщений по выделению сомаклонов картофеля с измененной формой клубней и их окраской, с устойчивостью к парше, к вирусам PVY и PLRV, тлям-переносчикам вирусов.

Эванс с сотрудниками (Evans and Sharp 1983; Evans et al., 1984; Evans and Bravo, 1986) выделили сомаклональные варианты, отличающиеся от исходных сортов томатов по таким признакам, как цвет плодов, архитектура растений, пригодность к механической уборке, устойчивость к болезням. В отличие от картофеля, эти сомаклоны были подвергнуты детальному генетическому анализу, который показал, что измененные признаки связаны с единичными генными мутациями. Например, было установлено, что признак цвет плодов имел рецессивный характер наследования, а устойчивость к фузариозу – доминантный. Один из сомаклонов томатов с более высоким, чем у исходного сорта содержанием сухого вещества (20%), улучшенным вкусом и консистенцией плодов, отличающийся по цвету плодов был зарегистрирован DNA Plant Technology Corporation (США) в качестве нового сорта.

Cassells et al. (1983) показали возможность выделения перспективных сомаклонов не только среди растений-регенерантов, полученных из каллюсных, суспензионных культур или из протопластов, но и среди растений, регенерированных непосредственно из стеблевых эксплантатов.