3.8 Тотипотентность растительных клеток

В отличие от животных, у которых клеточная дифференциация необратима, у растений даже дифференцированные зрелые клетки специализированных тканей сохраняют способность к возврату в меристематическое состояние (при условии, что у них имеется жизнеспособное ядро и мембранная система). При определенных условиях (in vivo или в культуре in vitro) дедифференцированные клетки могут дифференцироваться, что позволяет регенерировать ткани, органы или даже целое растений. Способность отдельных клеток растений менять программу развития, претерпевать дедифференцировку, вторичную дифференцировку и, в результате, давать начало целому растению, то есть реализовать заключенную в них генетическую информацию, получило название тотипотентности (от латинских слов ″totus″ - весь, целый и ″potentia″ - сила).

В природе свойство тотипотентности клеток обеспечивает растениям возможность заживления ран (с участием быстро делящихся недифференцированных клеток каллюсов), а также вегетативного размножения. У разных видов растений это свойство выражено в разной степени: сильнее у двудольных, слабее – у однодольных. Имеются существенные различия и в тотипотентности клеток разных тканей растений (наиболее тотипотентны эмбриональные и меристемные ткани).

Разработка методов культуры клеток растений in vitro дала возможность реализовать тотипотентность даже тех клеток, у которых она в растении практически не выражена, например, микроспор. Первоначально считалось, что это свойство при создании определенных условий культивирования реализуется любой растительной клеткой. Однако в настоящее время экспериментально доказано, что даже у отзывчивых к культуре in vitro видов растений не каждая клетка эксплантата тотипотентна. Тем не менее, именно применение методов культуры клеток растений позволяет целенаправленно индуцировать дедифференциацию и вторичную дифференциацию клеток многих видов растений, что дает возможность значительно расширить возможности использования свойства тотипотентности растительной клетки в практической деятельности.

3.9 Вторичная цитодифференцировка: гистогенез, органогенез, эмбриогенез

Развитие клетки специализированной ткани после ее дедифференцировки в каллюсную может проходить в следующих направлениях.

- Клетка претерпевает вторичную дифференцировку и прекращает делиться, то есть превращается в дифференцированную каллюсную клетку. Это нормальный цикл развития каллюсной клетки, заканчивающийся ее старением и отмиранием.

- Стойкая дедифференцировка каллюсной клетки, приобретение ею способности расти на среде без гормонов, т.е. превращение в опухолевую (свойственно некоторым клеткам старых пересадочных культур);

- Вторичная дифференцировка, сопровождающаяся гистогенезом (образованием в каллюсе различных тканей) или морфогенезом (возникновением организованных структур). Гистологическая дифференцировка каллюсных клеток может приводить к образованию млечников, волокон, трихом, элементов сосудистой системы – трахей и трахеид ксилемы, ситовидных трубок и клеток-спутниц флоэмы. Морфогенез проходит в виде органогенеза или соматического эмбриогенеза. Органогенез – это регенерация в культуре клеток in vitro отдельных органов растения: стеблей, корней, реже - флоральных элементов, зачатков листьев. Соматический эмбриогенез – образование эмбриоидов, то есть структур, напоминающих зиготические зародыши. Явление соматического эмбриогенеза впервые было обнаружено Стюардом и Коленбахом при культивировании суспензии клеток растений. Однако позднее было установлено, что формирование эмбриоидов может происходить и в каллюсной культуре, при культивировании пыльников и в других случаях. Как органогенез, так и соматический эмбриогенез могут иметь место не только в культуре клеток, но и в растениях in vivo (пример – адвентивная полиэмбриония у цитрусовых), а также в культуре in vitro непосредственно из эксплантата (прямой морфогенез).

С практической точки зрения наибольший интерес представляют стеблевой органогенез и соматический эмбриогенез, которые позволяют регенерировать из культуры клеток или непосредственно из эксплантата целое растение. В результате стеблевого органогенеза образуется однополярная структура, содержащая апикальную меристему стебля. При этом формирующийся стебель сохраняет контакт с помощью сосудистой системы с материнской тканью. Образовавшиеся в культуре клеток проростки можно укоренить (in vitro или in vivo) и получить, таким образом, целое растение. В результате соматического эмбриогенеза формируется двуполярная структура (эмбриоид), которая содержит как стеблевую, так и корневую меристему. Эмбриоиды не имеют сосудистого сообщения с материнскими тканями. В культуре in vitro при определенных условиях эмбриоиды также способны развиться в растение.

Уже в начале 1990-х годов сообщалось, что растения-регенеранты были получены в культуре клеток у более чем 1000 видов растений. В результате установлены общие закономерности в протекании этого процесса. У двудольных растений легче, чем у однодольных, добиться не только каллюсообразования из эксплантатов, но и морфогенеза (органогенеза или эмбриогенеза) из каллюса. Среди двудольных более высокую регенерационную способность имеют виды, относящиеся к пасленовым, крестоцветным, зонтичным, а пониженную – к бобовым. Наиболее низкую регенерационную способность имеют злаковые культуры. В рамках отдельных видов имеются генотипы с относительно высокой и низкой способностью к морфогенезу.

На способность изолированных растительных клеток к морфогенезу оказывают влияние различные факторы, связанные как с самим растением, так и условиями культивирования. Большое значение имеет возраст растения (особенно для древесных культур и злаковых), его физиологическое состояние, состояние здоровья растения, условия, в которых оно выращивалось, а также часть растения (орган), из которого берется эксплантат, физиологический и онтогенетический возраст органа, время года, когда производится эксплантация, размер эксплантата и даже его ориентация и степень погружения при помещении на питательную среду. Наиболее высокую регенерационную способность имеют, как правило, клеточные культуры, полученные из эксплантатов, происходящих от молодых здоровых растений из эмбриональных (зрелые или незрелые зародыши) или меристематических тканей. В процессе субкультивирования регенерационная способность культуры клеток постепенно снижается (быстрее к стеблевому органогенезу, позднее – к корневому) и во многих случаях утрачивается. Гормононезависимые культуры и культуры опухолевых клеток, как правило, не способны к регенерации органов и формированию эмбриоидов (если стеблевые зачатки и формируются, то они, как правило, имеют неправильную форму, получить из них здоровое растение не удается).

Из факторов, связанных с культивированием клеток растений, наибольшее значение для морфогенеза имеет состав питательной среды, в особенности состав и соотношение фитогормонов (регуляторов роста), ее консистенция (жидкая или агаризованная), а также условия культивирования: температура, выращивание в темноте или с освещением, характер освещения (спектральные характеристики света, интенсивность освещения и длина фотопериода), использование стрессовых воздействий на культуры (например, перепад температур), воздействие на культуры электрическим током и другие.