3.3 Гетерогенность каллюсной ткани. Генетические и эпигенетические изменения клеток в культуре in vitro

В отличие от меристемных клеток, для которых характерны высокая однородность и генетическая стабильность, рост каллюсных клеток, их вторичная дифференцировка происходят неорганизованно и асинхронно. Каллюсная ткань может содержать паренхимные клетки, меристематические, некротические, а также элементы проводящей системы. В каллюсной ткани одновременно присутствуют клетки, находящиеся на разных стадиях митотического цикла. Клеточный цикл у них более длительный, чем у клеток меристемы.

Культура каллюсных тканей обладает не только гетерогенностью по степени и направлениям дифференцировки клеток, но и гетерогенностью по цитогенетическим характеристикам. Прежде всего, обращает внимание присутствие в каллюсной культуре клеток разной плоидности (в том числе с высоким уровнем плоидности - 6-8х и более) даже в тех случаях, когда в качестве эксплантата использовались меристематические ткани, содержащие исключительно диплоидные клетки. В процессе культивирования доля полиплоидных клеток, как правило, увеличивается.

Для культуры каллюсных клеток характерна высокая частота нарушений митоза, что приводит к появлению у них многочисленных хромосомных аберраций. В результате специальных генетических исследований было показано, что в процессе культивирования каллюсных клеток с относительно высокой частотой возникают разнообразные точковые мутации.

Важно отметить, что многие из перечисленных генетических изменений могут быть «перенесены» на организменный уровень путем получения из генетически измененных клеток растений-регенерантов. Явление генетической изменчивости растений-регенерантов, полученных в культуре клеток in vitro (не только из каллюсных культур, но и клеточных суспензий, культуры протопластов) получило название сомаклональной изменчивости. Оно имеет большое практическое значение и может быть использовано для получения полиплоидов, мутантных генотипов. Причины сомаклональной изменчивости и направления ее практического использования будут рассмотрены в главе 6.

3.4 Явление “привыкания” (гормононезависимость)

Для поддержания деления каллюсных клеток в культуре in vitro необходимо присутствие в питательной среде ауксинов и цитокининов. Однако при длительном культивировании могут появляться клеточные клоны, способные расти на среде без регуляторов роста. Это явление получило название «привыкания». Ткани, образованные «привыкшими» клетками (автономными по отношению к экзогенным ауксинам и цитокининам), называются гормононезависимыми. Их еще называют «химическими опухолями», поскольку кроме «привыкших» каллюсных тканей свойством гормононезависимости в культуре in vitro обладают и растительные опухоли естественного происхождения. Наиболее изученными из них являются корончатые галлы - опухоли, индуцированные у двудольный растений агробактериями.

Общим свойством химических и природных опухолей растений является их гормононезависимость. У «привыкших» тканей гормононезависимость достигается в результате изменения активности генов, отвечающих за синтез ферментов, участвующих в синтезе фитогормонов. Таким образом, изменения метаболизма каллюсных клеток, связанные с синтезом собственных фитогормонов, носят у них эпигенный характер, хотя нельзя исключить и возможность появления определенных мутаций. В опухолевых тканях синтез гормонов связан с переносом в геном растительных клеток бактериальных генов, отвечающих за этот процесс, в результате которого происходит их трансформация: превращение из здоровых в опухолевые.

Онкологическое заболевание растений - корончатый галл - издревле известно людям (его упоминание имеется еще в трудах Аристотеля). Этой болезни, имеющей серьезные агрономические последствия из-за нарушения нормального роста растений, подвержены многие двудольные растения: виноград, косточковые фруктовые деревья, розы и др.

В начале прошлого века был установлен возбудитель заболевания – почвенные бактерии из рода Agrobacterium: A. tumefaciens (вызывает у растений образование опухоли – корончатого галла), A. rhizogenes (вызывает образование на стебле растений многочисленных корней – «бородатый корень» (“hairy root”), A. rubi (возбудитель галлов у тростника). Однако только в 1970 годах удалось раскрыть механизм патогенеза. Van Lareke et al. (1974), Zaenen et al. (1974) установили, что у вирулентных штаммов A. tumefaciens в отличие от невирулентных имеется большая плазмида, получившая название Ti (от англ. tumor inducing – индуцирующая опухолеобразование) - у A. tumefaciens и Ri (root inducing –индуцирующая образование корней) - у A. rhizogenes.

В ходе дальнейшего изучения этих плазмид выяснилось, что опухоль возникает в результате необратимого переноса и включения определенного фрагмента (Т-ДНК, т.е. переносимой ДНК) плазмиды в хромосомную ДНК растительной клетки [Chilton et al., 1977]. Причем гены, расположенные на Т-фрагменте ДНК бактериальной плазмиды, активно экспрессируются в растительной клетке, что выражается в синтезе большого количества специфических соединений опинов – октопинов и нопалинов - при заражении A. tumefaciens или агропинов при заражении A. rhizogenes. Помимо этих соединений в клетках образуются в повышенных концентрациях различные фитогормоны (ауксины и цитокинины), резко стимулирующие ростовые процессы, что приводит к образованию опухоли. Опины, экскретируемые инфицированными клетками, служат источником азота, углерода и энергии для возбудителей заболевания – агробактерий, поскольку у них на Ti-плазмиде имеются гены, кодирующие ферменты, необходимые для катаболизма этих соединений.

По-видимому, работы по культуре in vitro растительных опухолей, обнаружение у них явления гормононезависимости способствовали появлению интереса ученых к раскрытию его механизма. Результатом изучения природы агробактериальной трансформации стала разработка основного и наиболее эффективного метода переноса генов, сконструированных in vitro, в растительную клетку с целью получения трансгенных растений.