2.5 Условия культивирования. Перенос культур на свежую питательную среду

В зависимости от типа эксплантата и целей эксперимента для культуры клеток используют различные культуральные сосуды (стеклянные или пластиковые пробирки, чашки Петри разного размера, колбы и контейнеры) и условия культивирования. Культивирование производят в культуральных комнатах, оборудованных кондиционером. Многие культуры выращивают в темноте в термостатах. Оптимальная температура 24-26^оС. Однако, в зависимости от вида растений, она может быть немного выше или ниже.

Если требуется освещение культур (для поддержания культур пробирочных растений, клонального размножения растений in vitro и др.), в простейшем случае, в культуральной комнате размещают стеллажи с подсветкой лампами дневного света. Лампы включаются и выключаются автоматически в определенное время. Обычно длина светового периода составляет 14-18 час, темнового – 6-10 час. Температура в световой период может быть 22-26^оС, в темновой – несколько ниже, 16-18^оС. Освещенность культур варьирует в достаточно широких пределах (от 1 до 10 тыс. люкс). Для освещения культур чаще всего используют лампы дневного света. Однако могут применяться и другие лампы, в том числе со специфическими спектральными характеристиками.

Температурный и световой режим культивирования, спектральные характеристики света могут оказывать существенное влияние на индукцию процессов морфогенеза в культуре клеток растений. Поэтому для установки различных режимов культивирования целесообразно использовать климатические камеры.

Для культивирования клеточных суспензий в культуральной комнате устанавливают качалки, ротационные установки или более сложные приспособления для перемешивания и аэрации культур (биореакторы).

В процессе культивирования каллюсные клетки стареют (дифференциация каллюсных клеток), теряют способность делиться и постепенно отмирают. Также происходит истощение питательной среды, в нее могут выделяться клеточные метаболиты, которые оказывают неблагоприятное влияние на рост культур. Сама культура может существенно увеличиться в объеме, в результате чего размеры культурального сосуда становятся недостаточными. В связи с этим через определенные промежутки времени небольшой фрагмент каллюса, или объем суспензии (инокулят), переносят в стерильных условиях в приготовленные сосуды со свежей питательной средой (пассирование, субкультивирование). При регулярном пассировании способность к делению каллюсных клеток или клеток в суспензии может поддерживаться в течение десятков лет. Пробирочные растения при субкультивировании черенкуют: на свежую питательную среду переносят небольшой фрагмент растения, например, кусочек стебля с 1-2 пазушными почками, из которого восстанавливается пробирочное растение.

Перенос культур с одной среды на другую применяют также для индукции у них процессов морфогенеза, прежде всего, с целью получения растений-регенерантов. Это обусловлено тем, что питательные среды для пролиферации и морфогенеза клеточных культур, как правило, существенно различаются. Одновременно с пассированием нередко изменяют и условия культивирования (световой и температурный режим).