Глава 2

Методические основы культивирования органов, тканей, клеток и протопластов растений in vitro

Для получения культуры клеток in vitro небольшой фрагмент тканей растений (эксплантат) помещают в культуральный сосуд (пробирку, колбу и др.) на искусственную питательную среду, на которой клетки эксплантата начинают делиться, образуя каллюс. Каллюсная культура – наиболее обычный и распространенный вариант культуры клеток растений in vitro. Ее получают из эксплантатов при их культивировании на поверхности полутвердых (чаще всего агаризованных) питательных сред. При культивировании клеток в погруженном состоянии в жидких питательных средах получают суспензии клеток растений (суспензионные культуры). Использование ферментных растворов, растворяющих клеточные стенки, дает возможность получить протопласты – клетки растений, лишенные целлюлозной оболочки. Протопласты можно культивировать на жидких питательных средах или высевать суспензию протопластов на поверхность агаризованной питательной среды. Со временем протопласты восстанавливают клеточную стенку и переходят к делению, образуя каллюсную ткань. При определенных условиях каллюсные культуры, суспензии клеток способны к морфогенезу и/или соматическому эмбриогенезу, что дает возможность получать растения-регенеранты. Растения-регенеранты могут также быть получены непосредственно из эксплантатов. Их можно выращивать длительное время и размножать в культуре in vitro (культура пробирочных растений).

Работы по получению и поддержанию всех названных или отдельных видов культуры органов, тканей, клеток и протопластов растений (далее – культуры клеток растений) требуют специальных помещений, оборудования, инструментов, предполагают использование сложных питательных сред. Помещения, инструменты, лабораторная посуда и питательные среды подвергаются стерилизации с помощью различных методов. Многие работы проводятся с соблюдением правил асептики.

2.1. Помещения, оборудование и инструменты для работ по культуре клеток растений

Для проведения работ по культуре клеток растений требуются лабораторные комнаты для мытья и стерилизации посуды и инструментов, для приготовления и стерилизации питательных сред, для цитологических исследований, для получения, пассирования и других манипуляций с клеточными культурами, для культивирования клеток растений, боксовая или грунтовая теплица с искусственным освещением.

В комнате для мытья посуды, как правило, имеется аквадистиллятор (аквабидистиллятор). Дистиллированная вода необходима для приготовления питательных сред, поласкания вымытой посуды, эксплантатов после их обработки стерилизующими агентами. Вымытую посуду просушивают в суховоздушном шкафу при 80-100⁰ С. Высокая температура также обеспечивает ее стерилизацию.

Для работ по культуре клеток растений используют посуду стеклянную химическую различного типа и объема для приготовления питательных сред и хранения запасных растворов, получения и манипуляций с культурами (вычления и стерилизации эксплантатов, пассирования культур, черенкования пробирочных растений и др.), для культивирования: колбы, стаканы, чашки Петри, пробирки, мензурки, мерные цилиндры, пипетки. В последнее время широкое применение нашла разнообразная пластиковая посуда для культуры клеток растений разового использования. Однако во многих случаях удобнее и дешевле использовать стеклянную посуду.

В комнате для мытья посуды нередко размещают автоклавы, которые необходимы для стерилизации питательных сред и посуды, а также отдельный суховоздушный шкаф для стерилизации инструмента. Инструменты стерилизуют при 160^оС в течение 4 час, помещая их в металлические пеналы. Минимальный набор инструментов включает: пинцеты разной длины с тупыми и острыми концами, скальпели, ножницы и щипцы медицинские. В процессе работы инструменты размещают на специальном штативе или стерилизованных чашках Петри, после каждой операции их погружают в 96% спирт и прожигают в пламени спиртовки, затем охлаждают (Рис. 2.1)

В комнате для приготовления питательных сред должны быть различные весы, лабораторный рН-метр, электроплита и водяная баня для приготовления агаризованных питательных сред (для небольших объемов можно использовать микроволновую печь), холодильник, морозильник, магнитная мешалка, вытяжной шкаф. В этой же комнате, или отдельном помещении, могут располагаться микроскопы (обычные и/или инвертированные), бинокулярные лупы, счетчики клеток и другое оборудование и инструменты, необходимые для цитологических исследований, манипуляций с протопластами.

Все работы, непосредственно связанные с культурой клеток растений (вычленение и стерилизация эксплантатов, пассирование культур, черенкование пробирочных растений и др.), проводят в ламинар-боксах, которые размещают в отдельном помещении или в комнате для приготовления питательных сред, проведения цитологических исследований (Рис. 2.2). Ламинар-бокс (камера обеспыливания) представляет собой стол с поверхностью из нержавеющей стали, изолированный от окружающей среды сверху, сзади, слева и справа. В рабочее пространство ламинар-бокса (над столом) поступает под давлением стерильный воздух, что обеспечивает условия асептики, необходимые для работ по культуре клеток растений. Воздух засасывается в ламинар-бокс из помещения с помощью специального насоса и пропускается через фильтры грубой и тонкой очистки, которые задерживают не только частицы пыли, но и клетки микроорганизмов. Различают ламинар-боксы горизонтальные и вертикальные (в зависимости от направления движения стерильного воздуха в рабочем пространстве), в равной степени эффективные. Перед началом работы поверхность стола ламинар-бокса обеззараживают с помощью бактерицидной УФ-лампы, встроенной над поверхностью стола (в течение 30 мин - 1час), затем стол протирают 70% раствором этилового спирта.

В качестве культуральной комнаты обычно используют изолированное помещение, оборудованное кондиционером. В нем размещают термостаты (культивирование клеток растений в темноте). Однако во многих случаях при культивировании клеток растений требуется освещение. Для этого, в простейшем случае, в культуральной комнате размещают стеллажи с лампами дневного света (Рис. 2.3). Лампы могут располагаться сверху над полками или по центру между двумя полками (культуры освещаются в этом случае в основном сбоку). Лампы включаются и выключаются автоматически в определенное время. Для культивирования клеток растений могут использоваться также различные климатические камеры с регулируемым режимом освещения, температуры и влажности.

Для работ по культуре клеток растений необходима боксовая или грунтовая теплица с искусственным освещением. Во-первых, в ней могут выращиваться растения, с которых берут эксплантаты. Эксплантаты, полученные с таких растений, как правило, менее инфицированы, чем от растений, выращиваемых в поле. Кроме того, успех культивирования клеток растений и получения растений-регенерантов в некоторых случаях в значительной степени зависит от условий выращивания (температура, режим и способ освещения) растений-доноров эксплантатов (например, при получении гаплоидов в культуре пыльников). Во-вторых, теплица необходима для высадки в грунт полученных растений-регенерантов, так как их перенос в условия in vivo из пробирок требует специальной адаптации.