1.6. Технологія розріджування, зберігання та транспортування сперми. План

1.Значення і необхідність розрідження сперми, вимоги до розріджувачів.

2.Способи зберігання сперми бугая, барана, кнура, жеребця при температурі + 2 - + 5^о С.

3. Теоретичні і практичні основи заморожування сперим, значення.

4.Підготовка сперми до заморожування.

5.Технологія заморожування сперми в гранулах, пайєтах, ампулах.

6.Зберігання сперми у рідкому азоті та транспортування сперми.

 Література

1.І.І.Карташов, Г.С. Шарапа Акушерство гінекологія і штучне осіменіння сільськогосподарських тварин. – К.: Вища школа 1991. с. 75 – 94,

2.Н.Н.Михайлов Акушерство, гинекология и искусственное осеменение сельськохозяйственних животних М.: Агропромиздат 1990. с.

3. Яблонський В.А., Хомін С.П., Калиновський Г.М., Харита Г.Г. та інші Ветеринарне акушерство, гінекологія та біотехнологія відтворення тварин з основами андрології. – ПП.: Нова книга 2006. с. 142 - 155

4.В.М.Яблонський Практичне акушерство гінекологія та біотехнологія відтворення тварин з основами андрології. - К.: Мета 2002. с.

! Основні терміни і поняття

Розріджувачі для сперми: ГЦЖ – глюкозоцетратножовтковий, ГЖ – глюкозо – жовтковий, ГХЦС - глюкозохелатоцетратний; температура замерзання кисню -183 ^о С, температура замерзання рідкого азоту -196 ^о С, температура замерзання вуглекислоти -79 ^о С, облицьовані гранули пайєти, соломинки, термоси, посуди Дюара.

Теоретичні вказівки

Нова

Таким чином, для розрідження сперми використовують як синтетичні, так і біоло­гічні середовища. Склад середовища залежить від того, для якого виду тварин та для якого режиму зберігання воно призначене. Для зберігання сперми при 2-5 °С широко застосовуються жовткові середовища.

Розріджувачі, що використовуються для зберігання сперми у замороженому ви­гляді, містять у своєму складі кріопротектори (гліцерин, етиленгліколь, поліетиленок- сид, рафінозу та ін.).

Для пригнічення мікрофлори до складу розріджувачів додають сануючі речовини: білий стрептоцид, пеніцилін кристалічний (натрієва або калієва сіль) та стрептомі­цин сірчанокислий або солянокислий, або суміш цих препаратів під назвою "Спер- мосан - З".

У багатьох країнах були запропоновані сухі синтетичні препарати (семінал і нео- семінал, спермозол, лаціфос, капроген та ін.), які перед використанням розріджують у певному об'ємі дистильованої води.

Компоненти розріджувача проявляють різноманітний вплив на спермії; неелек- троліти (моно- і поліцукри) підтримують у розчинах осмотичний тиск, проявляють захисну дію під час заморожування, інактивують антитіла, зменшують електропровід­ність сперми, сприяють збереженню електричного заряду сперміїв, перешкоджають їх аглютинації; глюкоза та фруктоза можуть служити джерелом енергії; амінокислоти у розчинах створюють осмотичний тиск, виконують роль амфотерного буфера. Окремі лужні та амфотерні водорозчинні амінокислоти виконують захисну функцію, знижу­ють активність ферментів та інтенсивність обмінних процесів у сперміях; зв'язуючи кисень та перекис водню, амінокислоти можуть виконувати роль антиоксидантів.

Проте неелектроліти слабо захищають спермії від холодового удару, не забезпечу­ють буферності та електропровідності середовища.

Електроліти (цитрат натрію, тартрат, бікарбонат натрію, сульфат амонію та ін.) захищають оболонку сперміїв від набухання і знижують її проникність, позитивно впливають на обмін речовин, нейтралізують шкідливу дію токсичних продуктів об­міну, частково захищають спермії від температурного шоку; електроліти утворюють у середовищах буферну ємність, електропровідність, створюють рН розчину.

Речовини, що утворюють електролітну основу, складаються з аніонів та катіонів. Аніони проявляють сильнішу дію на зберігання сперміїв, ніж катіони. Чим вища валент­ність аніонів, тим краще виживання у їх розчинах сперміїв. Наприклад, хелатон (чоти­ривалентні аніони) проявляє найсильнішу дію на окисно-відновні процеси у сперміях. Будучи сильним комплексоном, він тимчасово зв'язує іони металів кальцію і магнію, гальмує активність протеаз, аденозинтрифосфатаз, фосфофруктокінази, гексодифосфа- тази та інших ферментів, знижує обмінні процеси у сперміях. Крім того, він володіє високими буферними властивостями і гальмує розвиток мікроорганізмів у спермі.

Жовток захищає спермії від холодового удару, при температурі нижче 16 °С під­вищує стійкість клітин проти дії токсичних речовин, гіпо- і гіпертонічних розчинів, світла та інших факторів зовнішнього середовища. Проте при швидкому охолоджені сперми, розрідженої цукрово-жовтковими середовищами, можливий шок.

Серед кріопротекторів у середовищах для заморожування сперми (гліцерин, етиленглікольполіетиленоксид, рафіноза та ін.) найвищими захисними властивостя­ми при заморожуванні володіє гліцерин. Він затримує початок кристалізації води і сповільнює ріст кристалів, знижує осмотичний тиск розчинених речовин при замо­рожуванні до евтектичної точки (-46,5 °С). Гліцерин завжди знаходиться у фазі роз­чину, внаслідок чого концентрація осмотично активних речовин зменшується, що сприяє зберіганню клітин. Проте гліцерин не індиферентна речовина по відношенню до сперміїв. Вже при концентрації 3,5 % він проявляє сильну гіпотонічну дію. При зменшенні концентрації гліцерину у середовищі зменшується його захисна дія, а при збільшенні концентрації і часу контакту при плюсовій температурі він проявляє руй­нівний вплив на структуру сперміїв.

Сануючі речовини (антибіотики, сульфаніламіди та хіміотерапевтичні препарати, спермосан - 3 та ін.) поряд з пригніченням росту мікроорганізмів дещо знижують об­мінні процеси сперміїв, тому не можна ними зловживати.

стара

Способи зберігання сперми

Залежно від специфіки роботи племоб'єднань, їхньо­го матеріально-технічного забезпечення та умов роботи пунктів у господарствах застосовують нетривале або тривале зберігання сперми плідників.

Нетривале зберігання сперми. Сперму бугая, барана, жеребця і кнура, розбавлену глюкозоцитратно-жовтко- вим чи хелатоновими розріджувачами, зберігають при температурі 2—5 °С або 16—20 °С протягом 1—3 діб. Сперму бугая і барана транспортують у харчових термо­сах з широкою шийкою, сперму жеребців — у спеціаль­них термосах-ящиках або харчових термосах з широ­кою шийкою. Для зберігання і транспортування сперми кнурів використовують термоси-ящики та побутові сум- ки-холодильники.

Розбавлену сперму бугая і барана розфасовують і зберігають у простерилізованих скляних флаконах і ампулах.

Важливою умовою зберігання розбавленої сперми є поступове її охолодження і підтримання постійного тем­пературного режиму за допомогою термосів. Розбавлену сперму поступово охолоджують до кімнатної температу­ри (18—25 °С). Наповнені спермою флакони чи ампули вставляють у гумовий або поліетиленовий мішечок і підв'язують міцною ниткою. Потім обгортають шаром вати і упаковують у поролонові амортизатори для рівно­мірного охолодження в термосах до температури 2— 5 °С.

На дно термоса кладуть шар вати і до половини його засипають кусочками льоду. Потім у нього вставляють підготовлену сперму і зверху засипають шаром льоду.

Термос закривають пробкою і кришкою. Щоб вийняти упаковану сперму із термоса, треба потягти за кінець нитки, яка знаходиться зверху. При використанні збе­реженої сперми у разі потреби в термос періодично до­бавляють кусочки льоду.

Сперму на пунктах штучного осіменіння можна збе­рігати в холодильниках при температурі 2—5 °С. Розбав­лена сперма бугая при правильному зберіганні придатна для осіменіння самок протягом 2—3 діб, а барана — до 24—36 год. Для осіменіння допускається сперма бугая з активністю сперміїв не менш як 7 балів і барана 8 ба­лів.

Сперму кнура можна використовувати нерозбавле- пою протягом 2—3 год після її одержання. Сперму, розбавлену хелатоновими середовищами, розфасовують у поліетиленові флакони або скляні ампули. Отвори по­судин тимчасово закривають пергаментним папером або целофаном, фіксуючи їх гумовим кільцем. На пункти сперму доставляють у спеціальних термосах, де її збе­рігають у погрібцях-термосах при температурі 16—20 °С і використовують протягом 3 діб.

Для оцінки рухливості сперміїв слід користуватися підлужним розчином (натрію хлориду —450 мг, глюко­за—З г, сода двовуглекисла — 50—70 мг і вода ди­стильована — 100 мл). Рухливість сперміїв при ОСІМЄНІНт ні свиноматок повинна бути не менш як 6 балів.

Розбавлену і перевірену сперму жеребця розфасову­ють в ампули чи скляні баночки об'ємом 50—100 мл, закривають пробками, які фіксують гумовими кільцями. Упаковану сперму ставлять у мішечки, а потім у термос з льодом і зберігають при температурі 2—5 °С, періо­дично додаючи кусочки льоду через бічні отвори.

Рухливість сперміїв при використанні сперми повин­на бути не менш як 5 балів.

Довготривале зберігання сперми в рідкому азоті. Наприкінці 40-х років І. В. Смирнов вперше заморозив сперму кролів, жеребців, баранів і бугаїв. У 1950— 1961 рр. на території України він одержав перших телят і ягнят при осіменінні корів і вівцематок замороженою спермою. Сперму заморожували у твердій вуглекислоті (—79 °С), в рідкому кисні (—183 °С) і в рідкому азоті (—196°С). Останнім часом широкого практичного засто­сування набув метод заморожування і зберігання спер­ми за допомогою азоту.

Метод тривалого зберігання сперми плідників у за­мороженому стані дає змогу рівномірно за графіком використовувати бугаїв протягом року і створювати за­паси сперми. Заморожена сперма використовується за селекційним планом незалежно від місця перебування плідника, кліматичних умов тощо. З'явилась можли­вість міждержавного обміну спермою плідників та її ви­користання навіть після їхньої загибелі. Сперму в замо­роженому стані можна зберігати протягом місяців і років, якщо дотримуватися рекомендованого температур­ного режиму.

Заморожування і зберігання сперми бугая

Розроблено кілька технологій заморожування сперми бугаїв. Найбільш поширено такі технології: заморожу­вання в гранулах на фторопластовій пластині, в обли­цьованих гранулах (Ф. І. Осташко та in.), в соломинках (П. І. Пакенас та ін.).

Для заморожування беруть високоякісну сперму. Активність сперміїв бугая повинна бути не нижча за 8 балів, а концентрація — не нижча за 0,7 млрд/мл; сперма жеребця — відповідно 6 балів і 150 млн/мл.

Заморожування сперми у формі гранул. Сперму замо­рожують після її оцінки і розбавлення лактозогліцери- ново-жовтковим середовищем (лактоза—11,5 г; гліце­рин — 5 мл; жовток курячого яйця — 20 мл; спермо- сан — 50 тис. ОД., вода дистильована—100 мл). Розбавляють у співвідношенні 1 : 1 — 1 : 3 і охолоджують при температурі 2—5 °С протягом 4—5 год у холодиль­нику (еквілібрація). Після цього сперму знову переві­ряють на активність.

У лунки фторопластової пластини сперму розфасо­вують після відповідної підготовки пластин (рис. 14). Сперму наносять на знезаражену променями бактери­цидних ламп пластину по 0,15—0,2 мл за допомогою градуйованої піпетки, шприца або автоматичного при­стосування. Спочатку пластини охолоджують у рідкому азоті протягом 8—10 хв, або до припинення кипіння азоту. Для цього використовують спеціальні ванни. Пластина охолоджується до мінус 160—170 °С.

Через кілька секунд після того, як в останній лунці сперма затвердіє, пластину опускають на відстань 5— 10 см від рідкого азоту і витримують протягом 2—3 хв,

а потім занурюють у нього на 1—2 хвилини. Далі плас­тину виймають назовні, збирають гранули за допомогою лопаточки в туби, каністри, пластмасові стаканчики чи марлеві мішечки і переносять у посудину Дьюара для ка- рантинування, зберігання і транспортування.

Рис. 14. Технологічна схема гранулювання сперми бугая.

До кожної туби чи іншої посудини із гранулами бу­гая прикріплюють етикетку з номером плідника, поро­дою, датою заморожування сперми, кількістю доз і т. ін. Гранулу розморожують в 1 мл 3 %-го розчину натрію лимоннокислого.

Цей метод порівняно простий, забезпечує високу ак­тивність сперміїв після розморожування гранул, набув широкого практичного застосування. Але він має ряд недоліків, пов'язаних з порушенням цілісності гранул у процесі зберігання, мікробною забрудненістю спермо- доз при використанні тощо.

нава

Нині сперму бугаїв заморожують у формі не облицьованих чи облицьованих гранул, у поліпропіленових соломинках, полістиролових піпетках, для цього опрацьовані від­повідні рецепти середовищ та технологія заморожування. Вагомий внесок у цю справу зробив Ф. І. Осташко з очолюваною ним школою дослідників. При одномоментному розрідженні сперми за технологією Ф. І. Остатка через 5-10 хв. після її отримання в неї вносять підігрітий до 30-35 °С розріджувач, що містить всі необхідні компонен­ти, в тому числі кріопротектор. При двомоментному розрідженні перше середовище

вносять у сперму зра­зу після її отримання, а тоді через 5-10 хв. проводять додатко­ве розрідження сере­довищем № 2.

Розливають роз­ріджену сперму у флакони, закривають їх стерильними гу­мовими корками і ви­тримують 4-6 годин у холодильнику при 2-5 °С (еквілібрація). Тоді приступають до заморожування спер­ми за тією чи іншою технологією.

П

Схема технології асептичного взяття, консервування та використання сперми бугаїв (за Осташком Ф.І.)

1 – механічне чучело, 2- зібрана штучна вагіна

ри заморожу­ванні сперми бугая у вигляді гранул на фторопластовій плас­тинці у парі рідко­го азоту занурюють пластинку на 1 хв. у рідкий азот (до при­пинення кипіння азоту), тоді закріплюють її на висоті 2-3 см над поверхнею азоту і за допомогою пластмасового шприца з голкою чи спеціальної крапельниці накрапу­ють сперму у ямки (заглиблення) пластинки по 0,1-0,2 мл (при виготовленні малих концентрованих гранул) чи 0,5-1,0 мл (для великих гранул). Витримують пластинку зі спермою 2-3 хв. над рідким азотом, тоді занурюють її на 1-2 хв. у азот, виймають і згортають гранули охолодженою лопаткою у марлеві мішечки чи контейнери і пере­носять у посудину Дьюара на зберігання. Проте необлицьовані гранули незахищені від мікробного забруднення.

Для одержання облицьованих гранул заповнюють розрідженою спермою поліети­ленову трубку діаметром 3,8-4 мм, товщиною стінки 120 мкм, розділяють її за допо­могою автоматичного приладу на окремі дози по 0,25-0,33 мл і загсрметизовують їх, охолоджують і заморожують. Потужність запропонованої Ф. І. Осташком технологіч­ної лінії - 2 000 спермодоз за 1 годину.

У 1975 р. Касу (Франція) вперше застосував для фасування сперми бугаїв поліпро­піленові соломинки (пайети) місткістю 0,5 мл. За цією технологією отриману сперму розріджують середовищем "Леціфос-271" з додаванням 10 % курячого жовтка або се­редовищем "Леціфос Пас-470", розфасовують її під вакуумом у соломинки, кінці яких герметизують полівініловим спиртом або запаюють зварювальним апаратом, марку­ють, витримують 2 години у воді температурою 5 °С і заморожують у парі азоту.

Згодом з'явилася технологія заморожування сперми у мініпайєтах об'ємом 0,25 мл, яка дозволила заготовляти від бугая 30-40 тис. спермодоз за рік.

Для розморожування замороженої в формі гранул сперми переносять її за допо­могою охолодженого пінцета у флакон з 1 мл 2,9 %-го розчину цитрату натрію, попе­редньо підігрітого у водянії! бані при температурі 4СМ-2 °С. Через 8-10 сек. виймають флакон зі спермою з водяної бані, оцінюють якість сперми і при рухливості сперміїв не нижче 4 балів сперму використовують для осіменіння.

Розморожування сперми у відкритих гранулах можна проводити і без викорис­тання 2,9 %-го розчину натрію цитрату. Для цього опускають гранулу у тонкостінну стерильну пробірку з випуклим дном, підігріту попередньо 4-5 хв. у водяному тер­мостаті до 38±0,5 °С, і після повного розморожування гранули набирають сперму у піпетку для осіменіння.

Розморожування сперми, замороженої у капілярах (пайетах) проводять у водя­ній бані з дистильованою водою чи розчином фурациліну (1 : 5000) при температурі 38^10 °С, поміщаючи в неї капіляр корком донизу у поліетиленовому мішечку. Потім пайету виймають, протирають марлевою серветкою, відрізають стерильними ножи­цями загерметизований кінець, перевіряють якість сперми і вставляють в інструмент для осіменіння.

Можна проводити і прискорене двоступінчасте розморожування за допомогою приладу УДС-1.

Відтавання облицьованих гранул також проводять протягом 8-10 сек. у водяній бані з дистильованою водою чи розчином фурациліну (1 : 5000) при температурі 38-40 °С. Розморожені гранули витирають стерильною серветкою, розрізають ножицями, пере­віряють під мікроскопом і при позитивній оцінці використовують для осіменіння.

Заморожену у вигляді гранул сперму барана розморожують таким чином: засипа­ють у розігрітий водяний чи електричний відтаювач одночасно до 20 гранул і дають можливість стекти розмороженій спермі у стерильний флакон.

Алюмінієві пакети із замороженою спермою жеребця занурюють за допомогою пінцету у водяну баню і легко похитують.

Заморожену у вигляді гранул сперму жеребця насипають одним шаром у стериль­ну конічну колбу і занурюють її у водяну баню.

При роботі з замороженою спермою та рідким азотом необхідно суворо дотриму­ватись техніки безпеки. Перш за все, техніки-оператори повинні працювати з рідким азотом у захисних окулярах та шкіряних рукавицях. Оголені ділянки тіла потрібно надійно захищати одягом.

Посудини Дьюара із замороженою спермою необхідно зберігати у добре вентильо­ваному приміщенні біля вікна, щоб можна було доливати рідкий азот через кватирку. За півгодини до роботи приміщення вентилюють. Заповнюють порожні посудини Дьюа­ра рідким азотом поступово, через гнучкий шланг, опустивши його наконечник до дна посудини. Ні в якому разі при цьому не можна заглядати у горловину посудини.

У процесі тривалого зберігання рідкого азоту в ньому поступово накопичується кисень (який підтримує горіння), тому через кожних 15-20 заправок зливають у без­печному місці зріджений газ і заповнюють посудину свіжим азотом.

Не можна закривати посудину Дьюара герметично, тому що під впливом випаро­вування рідкого азоту у ній виникає високий тиск, який може зірвати посудину. Не можна також користуватися посудиною Дьюара, горловина та верхня частина якої вкрилася льодом. Один - два рази на рік посудини відігрівають, очищають від домі­шок і дезінфікують.