1.5. Фізіологія і біохімія сперми. Методи оцінки якості сперми. План

1.Склад і видові особливості сперми, її фізіологічні та біологічні властивості.

2.Спермії їх будова, види та швидкість їх руху.

3.Дихання і гліколіз (фруктоліз) сперміїв.

4.Дія на спермії умов зовнішнього середовища.

5.Методи оцінки якості сперми: макро- і мікроскопічна.

5.1.Оцінка якості сперми за її густиною та активністю.

5.2.Визначення концентрації сперміїв.

5.3.Підрахунок патологічних форм сперміїв.

5.4.Визначення відсотка живих та мертвих сперміїв.

5.5.Визначення виживання, резистентності сперміїв.

6.Оцінка розрідженої та розмороженої сперми.

 Література

1.І.І.Карташов, Г.С. Шарапа Акушерство гінекологія і штучне осіменіння сільськогосподарських тварин. – К.: Вища школа 1991. с. 59 – 75.

2.Н.Н.Михайлов Акушерство, гинекология и искусственное осеменение сельськохозяйственних животних М.: Агропромиздат 1990. с.

3. Яблонський В.А., Хомін С.П., Калиновський Г.М., Харита Г.Г. та інші Ветеринарне акушерство, гінекологія та біотехнологія відтворення тварин з основами андрології. – ПП.: Нова книга 2006. с. 132 - 140

4.В.М.Яблонський Практичне акушерство гінекологія та біотехнологія відтворення тварин з основами андрології. - К.: Мета 2002. с.

! Основні терміни і поняття

Еякулят, манежний рух, коливальний рух, реотаксис, тигмотаксис, аглютинація, гліколіз, фруктоліз, депресія, анабіоз сперми, аспермія, некроспермія, олігоспермія, тератоспермія, олігосперматизм, фотоелектрокалориметр, концентрація сперміїв, резистентність сперміїв.

Теоретичні вказівки

ФІЗІОЛОГІЯ, БІОХІМІЯ І ОЦІНКА ЯКОСТІ СПЕРМИ

Сперма (сім'я) утворюється під час еякуляції вна­слідок змішування сперміїв (спермотозоїдів, живчиків) з секретами придатка і придаткових статевих залоз — плазмою сперми. Кількість сперми, виділеної плідником на одну садку, називають еякулятом.

Співвідношення між об'ємом сперміїв і плазмою у різ­них видів тварин є неоднаковим. Воно залежить від розвитку у них секреторної активності окремих статевих залоз. У спермі барана спермії становлять до ЗО % об'є­му еякуляту, бугая — до 14, а у кнура і жеребця — лише 7—8 %. В зв'язку з цим сперма барана і бугая більш на­сичена сперміями, тобто густіша, а кнура і жеребця — рідша.

У різних видів тварин у плазмі сперми переважають ті чи інші секрети придаткових статевих залоз. У спермі бугая, наприклад, до 40 % об'єму становить секрет мі- хурцевидних залоз, а в еякуляті барана до 50—60 % припадає на рідину придатків сім'яників. Основну ча­стину еякуляту кнура (до 60—70 %) становлять секрети передміхурової та міхурцевидних залоз.

За хімімним складом сперма є складною рідиною, 85—98 % якої —це вода (табл. 2). Вона багата на білки. В спермі бугая багато фруктози та лимонної кислоти. У спермі є різні ферменти і відносно багато солей.

Стор 60

Головною складовою частішою сперми є спермії — чоловічі статеві клітини, оскільки лише вони заплідню­ють яйцеклітини, а плазма відмиває сечостатевий канал від решток сечі, розбавляє густу масу сперміїв ізотоніч­ною рідиною, активізує рух сперміїв та забезпечує їх поживним матеріалом.

Завдяки різній кількості плазми об'єм еякуляту у бу­гаїв і баранів невеликий (1—5 мл), а у кнурів і жереб­ців великий (понад 100—200 мл).

Будова сперміїв. Спермій складається з головки, шийки, тіла і хвостика (рис. 11). Головка спермія має форму овальної пластини, вдавленої з одного боку, випук­лої з іншого. Вона поступово звужується спереду назад. Майже весь простір головки займає ядро, прикрите спе­реду ковпачком, акросомою. Зовні головка вкрита то­ненькою оболонкою, яка переходить далі па шийку, тіло і хвостик. Загальна довжина сперміїв тварин становить 58—70, а ширина 1—5 мікронів.

Спермії кожного виду тварин характеризуються пев­ним гаплоїдним (половинним) набором хромосом: у бу­гая — 30, барана — 27, кнура — 19, жеребця — 33. Кож­на хромосома в спермії має подібну собі в яйцеклітині.

Шийка — найбільш ламка частина спермія. Тут роз­міщені передня та задня центріолі. Це кінетичний центр активності спермія. Від дистальної центріолі відходить пучок волоконець, так звана осьова нитка, що проходить уздовж усього тіла і хвостика. Вона оточена подвійною (місцями потрійною) спіральною ниткою, яка склада­ється з великої кількості зерен — мітохондрій, з'єднаних білком в один ланцюжок. М і т о х о н д р і ї — метаболіч­ний апарат спермія. В них є ферменти, що забезпечують основні окислювально-відновні процеси

За хімічним складом спермії різко відрізняються від інших клітин. Вони містять близько 75 % води і 25 % сухої речовини (білки —85%, ліпіди—13,2, мінеральні речовини — 18 % ).

Головка спермія на 96 % побудована з білка, 3/4 яко­го становлять иуклеопротеїди — комплексні сполуки де­зоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) з простим білком. Через ДНК передаються спадкові властивості плідника.

Рух сперміїв. Характерною рисою сперміїв є висока рухливість. Внаслідок ритмічних хвилеподібних ударів хвостика то в один бік, то в інший він відштовхується, а ложкоподібна головка зумовлює обертання його нав­коло поздовжньої осі. Спермій при цьому гвинтоподібно просувається вперед зі швидкістю близько 5 мм за хви­лину. Швидкість руху сперміїв залежить від складу та температури середовища.

Розрізняють три види рухів спермія: прямолінійно- поступальний, манежний та коливальний. У свіжоотри- маній спермі переважна більшість сперміїв рухається прямолінійно-поступально, вперед, вздовж своєї поздовж­ньої осі, але поступово удари хвостика слабшають і він уже рухається по колу (манежно) або ж залишається на місці, лише хвостик його коливається в різні боки.

Сперміям властива здатність до реотаксису — ру­ху проти течії рідини та тигмотаксису — занурюва­нню в зустрічні клітини.

Спермоаглютинація. В повноцінній спермі оснозна маса сперміїв має однойменний негативний електричний заряд, що запобігає зіткненню їх під час руху. При ос­лабленні електричного заряду виникає аглютинація — склеювання сперміїв, спочатку головками, а потім всією масою. Аглютинації сприяє підвищення кислотності спер­ми, а в геніталіях самки наявність аглютинінів — продук­тів імунізації організму чужорідними білками.

Дихання і гліколіз. Джерелом енергії для руху спер­міїв є процеси обміну речовини: гліколіз, дихання, роз­клад та відновлення аденозинтрифосфату. Перші два про­цеси зумовлюють виділення енергії з поживних речовин, третій є перетворенням цієї енергії в таку форму, яка може діяти на скоротливий апарат спермія.

У спермі бугая та барана переважає гліколіз — роз­клад цукрів (фруктози, глюкози) до молочної кислоти, а в спермі кнура та жеребця, де цих цукрів мало, пере­важає дихання — окислення поживних речовин у присут­ності кисню з утворенням двоокису вуглецю та води.

Під час дихання можливе окислення вуглеводів, лі­підів і білків. Окислюються фруктоза і глюкоза, а також молочна кислота, що утворюється при їхньому розпаді. При цьому утворюються двоокис вуглецю, вода і аміак (при розпаді білків у спермі жеребця) і виділяється знач­на кількість енергії, яка використовується сперміями для РУХУ.

Дихання є основним енергетичним процесом для спер­міїв. Воно відбувається з участю ферментів (карбоксила- за, дегідрогеназа тощо) і посилюється з підвищенням температури і в лужному середовищі, а ослабляється при зниженні температури і в кислому середовищі. Чим ви­ща якість сперми, тим інтенсивнішим є процес дихання.

Сперму розводять штучними середовищами, до складу яких входить глюкоза або фруктоза, з метою збільшення кількості енергетичного матеріалу і припинення розпаду ліпідів і білків сперміїв, що є їхніми структурними еле­ментами.

Іншим джерелом енергії для сперміїв є розщеплення цукру без участі кисню — фруктоліз або гліколіз. Це менш економічний енергетичний процес, ніж дихання. Він є другорядним джерелом енергії порівняно з дихан­ням, але при відсутності кисню стає єдиним енергетичним процесом (у статевих органах самки, при зберіганні спер­ми поза організмом). Внаслідок фруктолізу утворюєть­ся молочна кислота, яку спермії виділяють через свою оболонку в навколишнє середовище.

Молочна кислота, що нагромаджується у спермі під час гліколізу, діє на спермії по-різному. Спочатку вона зумовлює початкову стадію анабіозу, коли рух сперміїв гальмується, проте з такого стану їх можна вивести пі­дігріванням. З подальшим нагромадженням молочної кислоти настає друга стадія анабіозу. Щоб вивести спер­мії з неї, крім підігрівання необхідно нейтралізувати молочну кислоту або зменшити її концентрацію. Для цьо­го до краплі сперми на предметному склі додають крап­лю цитрату чи хлористого натрію. При дальшому збіль­шенні кислотності спермії гинуть.

Дія зовнішніх умов на спермії

Виживання сперміїв поза організмом значною мірою залежить від співвідношення в спермі електролітів (со­лей) та неелектролітів (цукрів, органічних сполук). Од­ним з факторів, що зумовлюють високу живучість спермі­їв у придатку сім'яника, є знижений вміст електролітів. Під час еякуляції вміст електролітів у спермі збільшує­ться, а живучість сперміїв знижується. Чим сильніше сперма розбавлена секретами придаткових залоз, тим менше в ній виживають спермії.

Розчинені в плазмі сперми молекули та іони проявля­ють певний осмотичний тиск на спермії. Якщо сперму зберігають поза організмом, осмотичний тиск її зміню­ється внаслідок нагромадження продуктів обміну речо­вин. Осмотичний тиск слід враховувати, виготовляючи розріджувачі. Найкраще спермії виживають у середови­щах, осмотичний тиск яких збігається з осмотичним тис­ком всередині спермія. Такі розчини вважають ізото­нічними. В розчинах з вищим осмотичним тиском (гі­пертонічних) настає зморщування оболонки спермія, а в середовищах з меншим осмотичним тиском (гіпотоніч­них) — набухання і лопання головки спермія.

Величину осмотичного тиску виражають поняттям «д е п р е с і я», тобто величиною температури замерзан­ня розчину. Точка депресії сперми сільськогосподарських тварин становить 0,57—0,64.

Більшість ферментних систем проявляють свою актив­ність у межах певної реакції середовища. В кислому се­редовищі обмінні процеси гальмуються, а в лужному, наз- паки, стимулюються. В придатку сім'яника, де зберіга­ються спермії, реакція є кислою, і це гальмує їхню активність. Під час еякуляції через змішування сперміїв з секретами придаткових залоз реакція сперми стає слаб- кокислою чи навіть лужною, що активує спермії. В процесі зберігання сперми бугая та барана реакція її знову зміщується в кислий бік, і активність сперміїв гальму­ється.

Наявні в спермі солі слабких кислот (карбонати, ци­трати, фосфати) є буферами, які підтримують реакцію середовища в певних межах; буферну здатність мають також білки сперми. Життєздатність сперміїв поза орга­нізмом залежить від температури зберігання. Підігріван­ня сперми до 37—40 °С активізує рух сперміїв, при 42— 45 °С вони швидко стають нерухомими і втрачають за­пліднювальну здатність, а при 48 °С настає коагуляція білка. Тому температура 38—40 °С застосовується лише для оцінки активності сперміїв, але не для зберігання сперми. Зниження ж температури зберігання сперми галь­мує обмінні процеси та рух сперміїв і збільшує їхню жи­вучість. Проте різке охолодження сперміїв від темпера­тури тіла до 0°С зумовлює у них температурний шок (холодовий удар) — необоротну втрату активності та за­пліднювальної здатності. Тому при роботі зі спермою слід уникати різких охолоджень та використовувати такі роз­ріджувачі, що захищають спермії від холодового удару (жовток курячого яйця, гліцерин).

•У процесі еволюції ссавці пристосувалися до внут­рішнього осіменіння, тому світло згубно діє на спермії. На племпідприємствах та пунктах штучного осіменіння сперму оберігають від дії прямого сонячного випроміню­вання, застосовуючи марлеві занавіски на вікнах (роз­сіяне світло не є шкідливим) або ж розміщуючи лабора­торію для роботи зі спермою вікнами на північ. Можна також вставляти матові стекла у вікна та користуватися матовими електролампами. Якщо осіменіння тварин від­бувається на відкритому повітрі, флакони зі спермою та шприц-катетери накривають марлевими серветками.

Спермії дуже чутливі до дії різних хімічних речо­вин — лізолу, креоліну, формаліну, скипидару, перманга­нату калію, нашатирного спирту, лугів, кислот, нікотину тощо. Навіть у мінімальних кількостях вони згубно ді­ють на спермії. Тому категорично заборонено зберігати ці речовини на племпідприємствах і пунктах штучного осіменіння або ж влаштовувати пункти поблизу ветери­нарних установ. Для дезинфекції приміщень племпідпри- ємств та пунктів застосовують лише ті препарати, які не мають запаху. Не дозволяється також палити в цих при­міщеннях

Стор 65

Спермії дуже чутливі до впливу мікробів, грибів, ток­синів тощо. На них впливає і середовище статевих орга­нів самки, куди вони вводяться під час осіменіння. Ви­живаність сперміїв у секретах самки з невисокою в'яз­кістю і значною еластичністю вища, що відповідає най­кращому прояву ознак охоти й тічки. Якщо ж слиз гус­тий, з домішками гною, то спермії швидко гинуть. На них згубно діють також лікарські речовини, що їх уводять у статеві органи самки при лікуванні.

Отже, спермії чутливі до різноманітних факторів нав­колишнього середовища, а тому на всіх етапах роботи із спермою слід дотримуватися інструкції.

Оцінка якості сперми

Заплідшованість маточного поголів'я значною мірою залежить від якості сперми, використаної для осіменіння. Тому її обов'язково досліджують, щоб визначити при­датність для осіменіння, а також встановити допустимий ступінь розбавлення. Якість збережуваної сперми (рух­ливість сперміїв) треба перевіряти безпосередньо перед введенням її у статеві органи самок.

Досліджують кожен еякулят, тобто порцію сперми, виділену плідником під час однієї садки. Еякулят оціню­ють негайно після одержання. Еякуляти, які мають якіс­ні показники (табл. 3), нижчі за допустимі, не можна використовувати для зберігання та осіменіння або змі­шувати з нормальними еякулятами.

Спочатку здійснюють загальну санітарну оцінку спер­ми візуальним методом, вимірюють об'єм еякуляту, а по­тім за допомогою мікроскопа оцінюють густоту сперми та рухливість (активність) сперміїв. Крім того, визначають концентрацію сперміїв, встановлюють кількість нормальних і патологічних форм їх, виживаність при темпера­турі 38 °С, показник абсолютної виживаності та ін. Виз­начаючи об'єм, користуються градуйованими циліндрами або мензурками. Об'єм сперми жеребців і кнурів визна­чають після відфільтрування густих секретів придатко­вих статевих залоз.

Об'єм еякуляту в одноразовому поліетиленовому сі- м'яприймачеві встановлюють зважуванням на терезах типу ВЛК-20, ВЛК-50 або Р-2-200, знаючи стандартну масу відокремленої частини сім'яприймача. Маса 1 г сперми відповідає 1 мл.

Визначення густоти сперми і рухливості сперміїв за допомогою мікроскопа. Окомірна оцінка сперми під мік­роскопом є обов'язковим і простим методом визначення густоти сперми і рухливості сперміїв. її здійснюють у лабораторії (температура в приміщенні не повинна бути нижчою за 18—20 °С), використовуючи фанерний термо­стат при температурі 38—40 °С або спеціальний нагрі­вальний столик при збільшенні мікроскопа у 200—300 разів. Паличкою чи піпеткою наносять на тепле предмет­не скло краплю досліджуваної сперми і накривають її покривним склом. У краплі не повинно бути бульбашок повітря. Крапля нерозбавленої сперми повинна заповню­вати весь простір під покривним склом, але не витікати за його краї; стандартна товщина краплі потрібна для правильної оцінки густоти сперми.

Якщо оцінюють сперму, розбавлену жовтковим або молочним розріджувачем, слід брати крапельку малих розмірів, яка утворює під склом дуже тонкий шар, оскіль­ки в ньому краще видно спермії між кульками жовтка або молочного жиру.

Скло зі спермою кладуть на предметний столик мікро­скопа (або на поверхню нагрівального столика), регу­люють освітленість поля зору за допомогою діафрагми та дзеркала мікроскопа, наводять мікроскоп і визначають в тій самій краплі густоту сперми та активність сперміїв.

В изначають густоту (тобто насиченість сперміями) тільки нерозбавленої сперми. При цьому мають на меті з'ясувати, чи відповідає вона мінімальним вимогам для сперми даного виду тварин. За густотою сперми можна приблизно встановити можливий ступінь розбавлення її в будь-якому середовищі. Визначати густоту розбавленої сперми немає рації. За густотою нерозбавлена сперма може мати такі оцінки

Густа" (Г) — все поле зору суцільно заповнене спер­міями і між ними майже не видно проміжків. В 1 мл густої сперми міститься понад 1 млрд. сперміїв.

Середня (С) —проміжки помітні, але розміри їх менші від довжини сперміїв. У середній спермі міститься від 200 млн. до 1 млрд. сперміїв в 1 мл.

Рідка (Р) — проміжки більші від довжини спермія (міститься менш як 200 млн. в 1 мл).

Аспермія (А) — цілковита відсутність сперміїв.

Види тварин	Густа	Середня	Рідка
Баран	понад 2,0	1-2,0	менше 1,0
Бугай	понад 1,0	0,5-1,0	менше 0,5
Кнур	понад 0,21	0,11-0,21	менше 0,11
Жеребець	понад 0,25	0,11-0,25	менше 0,10

Досліджуючи рухливість сперміїв, визначають на око, скільки процентів сперміїв у полі зору мають нормаль­ний прямолінійний рух. Якщо всі спермії нерухливі, став­лять оцінку Н (нерухливість), манежний (круговий) рух сперміїв позначають буквою М, коливальний рух — бук­вою К-

Тепер застосовують десятибальну систему оцінки рух­ливості сперміїв. У густій спермі барана та бугая важко визначити, скільки процентів сперміїв має той чи інший

вид руху.

Доводиться ставити бал оцінки за такими ознаками: якщо у спермі спостерігається бурхливий вихроподібний рух (не змішувати з манежним рухом окремих сперміїв), ставлять найвищий бал (10), при дещо сповільненому вихроподібпому русі ставлять бали 9—8.

При охолодженні сперми, а також при нагромадженні в ній молочної чи вугільної кислоти рух сперміїв спо­вільнюється або зовсім припиняється, тому оцінку актив­ності слід давати тільки при температурі 38—40 °С.

Загальна оцінка сперми, яку записують до журналу, складається з букви, що позначає густоту, і з цифри, яка виражає активність сперміїв (наприклад, Г-8, С-9, Г-6). Оцінюючи розбавлену сперму, до журналу записують тільки цифру, що виражає рухливість сперміїв.

До використання допускають сперму бугаїв, кнурів і жеребців з оцінкою густа і середня, а сперму баранів — тільки густа. У дуже густих еякулятах спермії не можуть швидко вийти з стану нерухомості. Активність такої спер­ми визначають після додавання до неї 3 %-го розчину лимоннокислого натрію (38—40°С). Для цього на тепле предметне скло наносять дві краплі розчину і одну крап­лю сперми, які накривають покривним склом.

Визначенії;! концентрації сперміїв. Концентрацією сперміїв називають кількість їх у 1 мл сперми, виражену в мільйонах (кнур, жеребець) або в мільярдах (бугай, баран). її визначають за допомогою лічильних камер, електрофотокалорпметрів та оптичних стандартів.

Підрахунок сперміїв у лічильній камері здійснюється у камерах, що їх застосовують для визначення числа формених елементів крові (з сіткою Горяєва, Томма, Бюркера). Для сперми бугая і барана застосовується еритроцитарний меланжер з червоною кулькою, а для сперми кнура і жеребця — з білою.

Камеру і покривне скло миють водою і насухо витира­ють. Покривне скло кладуть над сіткою камери і, при­тискуючи великим пальцем до опорних площадок, при­тирають скло до появи в місцях дотикання райдужних кілець.

Змішувачі мають бути цілком чистими і сухими, для чого їх після кожного підрахунку промивають послідовно водою, спиртом та ефіром і висушують, продуваючи че­рез змішувач повітря з гумового балона. Показником чистоти і сухості змішувача є тс, що скляна бусинка все­редині пухирця легко перекочується і не прилипає до сті­нок. Насмоктувати і видаляти із змішувача рідину під час промивання зручніше за допомогою гумового балона.

У меланжер через гумову трубку, з'єднану з верхнім кінцем змішувача, до поділки 0,5 набирають сперму, а потім до верхньої поділки — 3 %-й розчин хлористого натрію. Затискують кінці змішувача між великим і вка­зівним пальцями і струшують протягом 2—3 хв, щоб сперма рівномірно змішалася з розчином.

Після цього із змішувача випускають перші 3—4 крап­лі, які не містять сперміїв, а п'яту наносять на середню частину камери біля верхнього краю притертого покрив­ного скла. Камеру встановлюють па столик мікроскопа так, щоб у полі зору вміщувався один великий квадрат сітки. Кількість сперміїв визначають у 5 великих квад ратах (80 малих) по діагоналі при збільшенні в 400 ра­зів.

Враховують головки сперміїв всередині малих квад­ратів, а також на їхніх лівих і верхній лініях.

Концентрацію сперміїв (у млрд/мл) визначають за спрощеною формулою діленням кількості сперміїв, об­числених у 80 малих квадратах камери, в спермі бугая і барана на 100, а в спермі кнура і жеребця—на 1000. Наприклад, якщо сперміїв у 5 великих квадратах 160, то концентрація сперміїв становить 160 : 100 = = 1,60 млрд/мл. Для точності визначення концентрації сперміїв рекомендують заправляти дві сітки і при під­рахунку брати середній показник.

Після роботи змішувачі, камери, предметне і покрив­не скло та піпетки миють звичайною і дистильованою во­дою, а потім із змішувачів і камер видаляють залишки води 96° етиловим спиртом і просушують ефіром.

Визначення концентрації сперміїв бугая за допомогою фотоелектрокалориметра. Метод придатний в основному для станцій штучного осіменіння. Точність визначення така сама, як і при застосуванні лічильної камери, але на одне^изначення затрачають лише 1—2 хвилини. Прин­цип роботи фотоелектрокалориметра (рис. 13) полягає у тому, що через кювету з досліджуваною (заздалегідь розбавленою) спермою пропускають пучок світла певної сили, який потім потрапляє на селеновий фотоелемент, з'єднаний з гальванометром. При цьому через гальва­нометр проходить електричний струм, величина якого обернено пропорційна мутності сперми (тобто концентра­ції сперміїв).

При застосуванні цього методу можливі великі помил­ки, якщо в спермі е лейкоцити, еритроцити, рештки зруй­нованих клітин, а також при інтенсивному забарвленні спермн і значних коливаннях температури навколишньо­го середовища (більш як на З °С).

До початку роботи треба старанно вивчити інструк­цію, яка додається до фотослектрокалориметра. За 15— 20 хв до початку вимірювань вмикають фотоелектрока- лориметр і вставляють зелений світлофільтр. Готують 3,5 %-й розчин лимоннокислого натрію: у мірну колбу всипають 3,5 г реактиву, доливають до позначки 100 мл дистильованою водою і після розчинення фільтрують.

У чисті пеніцнлінові флакони наливають по 10 мл 3,5 %-го лимоннокислого натрію. Набирають у мікро- піпетку 0,1 мл досліджуваної нерозбавленої сперми, об­тирають кінчик піпетки ватою і видувають сперму у фла­кон з розчином. Кілька разів прополіскують піпетку роз­чином з цього флакона, щоб усі спермії перейшли в розчин. Старанно перемішують рідину у флаконі, розбав­ляючи таким чином сперму у 100 разів. На флаконі пи­шуть кличку бугая і номер еякуляту.

Дві кювети заповнюють до позначки розчином цит­рату натрію, а в третю наливають з флакона розбавлену сперму. Одну кювету з чистим розчином вміщують у гніздо лівого кюветотримача, а другу — у гніздо правого на шляху світлового пучка. Кювети вміщують у затис­кач, розташований ближче до джерела світла.

Покажчик правого барабана встановлюють на нульову поділку за червоною шкалою оптичної щільності. Вми­кають гальванометр на малу чутливість. Обертаючи ру­коятку фотометричних клинів, встановлюють стрілку гальванометра на нуль. Потім вмикають максимальну чутливість і обертанням рукоятки нейтральних клинів знову встановлюють гальванометр на нуль; гальвано­метр вимикають.

Далі у вільний затискач правого кюветотримача вста­новлюють кювету з розбавленою спермою і повертанням кюветотримача вводять її в правий пучок світла. Вмика­ють гальванометр на малу чутливість; стрілка гальва­нометра відхиляється від нульового положення. Обер­танням вимірювального барабана її підводять до нуля, вмикають гальванометр на максимальну чутливість і ос­таточно встановлюють стрілку на нуль, обертаючи ви­мірювальний барабан. Гальванометр вимикають і відлі­чують за червоною шкалою правого барабана величину оптичної щільності.

Кювету з дослідженою спермою виймають з кювето- тримача, виливають вміст і старанно прополіскують її дистильованою водою, а потім спиртом і ефіром. Зовні кювету витирають чистою серветкою, а всередині осу­шують фільтрувальним папером.

Концентрацію сперміїв визначають за заздалегідь складеною калібрувальною кривою, яку будують один раз на місяць у таких самих умовах (температура тощо), в яких досліджують сперму. Для побудови кривої вибира­ють найбільш густий еякулят з концентрацією сперміїв понад 1 млрд. в 1 мл. Еякулят ділять на 5 частин, одну з яких залишають нерозбавленою, решту розбавляють 3,5 %-м розчином лимоннокислого натрію відповідно в 1; 2; 3 і 4 рази в окремих пеніцилінових флаконах. За допомогою лічильної камери визначають концентрацію сперміїв у кожному флаконі, причому для більшої точнос­ті кожне визначення повторюють 4—5 разів і обчислю­ють середню концентрацію.

Одночасно визначають оптичну щільність кожного зразка сперми за допомогою електрофотокалориметра. Потім будують калібрувальну криву, відкладаючи на го­ризонтальній осі концентрацію сперміїв, а на вертикаль­ній осі — оптичну щільність. Кожна поділка 0,05 шкали відповідає 100 млн. сперміїв в 1 мл нерозбавленої спер­ми бугая.

Результати записів наносять у вигляді точок, що ле­жать на перетині відповідних вертикалей і горизонталей, а потім з'єднують точки прямими і дістають калібруваль­ну криву.

Визначення концентрації за стандартами. За допомо­гою оптичних стандартів можна наближено визначити концентрацію сперміїв плідників. Стандарти — це запая­ні скляні пробірки з каламутною рідиною, яка за вигля­дом схожа на сперму жеребця або розбавлену сперму бугая. Густота (або мутність) рідини у різних пробірках відповідає різній концентрації сперміїв у спермі жереб­ця: Ю, 50, 100, 200, 300 і 500 млн. в 1 мл і в спермі бугая: 400, 600, 800, 1000 і 2000 млн. в 1 мл. Досліджувану спер­му бугая спочатку розбавляють у відношенні 1 : 5 1 %-м розчином хлористого натрію. Сперму (1—2 мл) налива­ють у додану до стандартів порожню пробірку з таким самим діаметром, що й пробірки з стандартами. Стан­дартні пробірки добре струшують і, дивлячись на світ­ло, підбирають стандарт, найбільш подібний за густотою до досліджуваної сперми. Якщо мутність сперми є про­міжною між двома стандартами, то концентрацію запи­сують теж проміжною.

Приклад І. Мутність сперми більша, ніж мутність стандарту 100 мли., але менша, ніж стандарту 200 млн. Концентрація сперміїв дорівнює 150 мли. в 1 мл.

Визначаючи концентрацію сперміїв кнура, до 0,1 мл профільтро­ваної сперми додають піпеткою фізіологічний розчин у такій кількості, щоб висота букв шрифта і оптична щільність були однакові з стан­дартом.

Розрахунок роблять за формулою

К = 50(л + 0,1),

де К концентрація сперми, млн/мл; п— об'єм доданого 1 %-го роз­чину хлористого натрію, мл; 50 — коефіцієнт.

Стандарт відповідає оптичній щільності сперми кнура з концент­рацією сперміїв 5 млн/мл.

Приклад 2. До сперми додали лише 4 мл 1 %-го розчину натрію хлориду:

К = 50(4 + 0,1) = 50 X 4,1 = 205 млн/мл.

Отже, в 1 мл досліджуваної сперми є 205 млн. сперміїв.

Визначення патологічних форм сперміїв. У разі за­хворювання сім'яників, придатків і придаткових стате­вих залоз, а також мошонки у спермі можуть з'явитися спермії з такими патологічними відхиленнями: з грушо­подібними, вузькими, карликовими, велетенськими, ко­роткими, потовщеними головками, безхвості, двоголові, двохвостові, з різними ненормальностями хвоста (закру­чений, розщеплений та ін.). Таке явище дістало назву гератоспермії і свідчить про глибокі порушення в стате­вих органах самця. Патологічні форми сперміїв слід виз­начати 3—4 рази за рік для кожного плідника, а також в усіх випадках різкого і стійкого погіршення якості сперми.

Для цього на кінцеву частину знежиреного предмет­ного скла наносять піпеткою невелику краплю сперми. До неї підводять краї скла з шліфованими краями і швидко розмазують краплю по предметному склу, нахи­ливши шліфоване скло в бік його руху. Мазок повинен бути настільки тонким, щоб він висихав протягом 1—2 хвилин. Після висихання скло з мазком опускають у ван­ночку з 96-градусним спиртом-ректифікатом на 1—2 хв для фіксації. Потім скло з мазком обполіскують водою, опускаючи на 3—5 хв у ванночку з фарбою, знову проми­вають у воді і після висихання досліджують під мікроско­пом при збільшенні в 400—600 разів. Окремо встанов­люють кількість нормальних і патологічних сперміїв, при­чому загальна кількість тих і інших повинна бути не менше 500 (для чого підрахунок здійснюють у кількох полях зору). Далі обчислюють процент патологічних сперміїв від загальної кількості їх.

Так, якщо з усієї кількості 510 сперміїв 112 було не­нормальних, то процент патологічних (П) становитиме Визначення виживаності сперміїв поза організмом.

Це один з кращих способів оцінки якості сперми. Спер­мії, які можуть довго жити поза організмом, здебільшо­го мають високу запліднювальну здатність.

Однак існуючі методи визначення живучості сперміїв потребують великих затрат часу (до 2—3 тижнів). Тому визначення абсолютного показника живучості має зна­чення не стільки для оцінки окремих еякулятів, скільки для характеристики відтворної здатності плідників. Виз­начають абсолютний показник живучості сперміїв, узя­тих від кожного плідника, 1—2 рази за місяць, причому для дослідження слід брати еякуляти з типовою для цьо­го плідника активністю, концентрацією та резистентніс­тю сперміїв.

Розбавлену сперму (1 мл) бугая чи барана зберігають при температурі 0°С. Один або два рази за добу краплю сперми досліджують під мікроскопом при температурі 38—40 °С на рухливість сперміїв. Це роблять доти, доки будуть спермії з прямолінійно-поступальним рухом. Через 3 доби після зберігання рухливість сперміїв повин­на бути не нижчою за 6 балів.

Виживаність сперміїв бугая після заморожування сперми визначають після її відтаювання. Рухливість сперміїв має бути не нижчою за 4 бали, а після 3-добо- вого зберігання прн температурі 0°С — не нижчою за 1 бал.

Оцінка збереженої сперми. Відомо, що нині в основ­ному використовується заморожена сперма плідників. її оцінюють за рухливістю і виживаністю сперміїв при тем­пературі 38 °С перший раз через 24 год після заморожу­вання, другий раз — через 28 днів після карантинування перед передаванням до спермобанку або завезенням у господарства.

Розморожена сперма повинна мати рухливість спер­міїв не менш як 4 бали з виживаністю їх у водяній бані при температурі 38 °С не менш як 5 год, абсолютною ви­живаністю — 12 одиниць, а бактеріальна забрудненість — не більш як 500 непатогенних мікробних клітин у дозі сперми.

Виживаність сперміїв рекомендують визначати екс- нрес-методом. З кожного замороженого еякуляту розмо­рожують по дві дози сперми, оцінюють рухливість спер­міїв і інкубують в автоматичній водяній бані при темпе­ратурі 38 °С. Через 5 год оцінку повторюють; якщо є живі спермії, сперму використовують. Виживаність краще виз­начати щогодини до припинення рухливості сперміїв.

Інші способи оцінки сперми. Для більш об'єктивної оцінки якості сперми додатково визначають резистент­ність (стійкість) сперміїв до 1 %-го розчину хлористого натрію.

Сперму оцінюють і за редукцією метиленової синьки при температурі 20—22 °С. Краплю сперми і крап­лю розчину синьки насисають у трубку стовпчиком близь­ко 2 см. Якщо сперма бугая знебарвиться менш ніж за 10 хв, то сперма доброякісна, від 11 до ЗО хв — се­редня.

Процент живих сперміїв встановлюють також спосо­бом зажиттєвого фарбування. Спосіб грунтується на властивості живих клітин не забарвлюватися деякими мікробіологічними фарбами, тоді як мертві клітини про­никні для барвників.

На предметне скло (ближче до кінця) наносять не­велику краплю нерозбавленої сперми, поруч з нею таку саму краплю 1,7 %-го розчину еозину, перемішують крап­лі скляною паличкою 1 с і швидко роблять мазок за до­помогою скла з шліфованими краями. Для цього до краю краплі підводять скло і швидко тягнуть за ним краплю до протилежного кінця предметного скла. Мазок повинен бути дуже тонким, а тому краплі слід брати не­великих розмірів. Висушивши мазок на повітрі, підра­ховують під мікроскопом підряд 500 сперміїв (у кіль­кох полях зору), виділяючи окремо сперміїв з головками, забарвленими у рожевий колір і незабарвленими. Спер­мії, які в момент забарвлення були живими, матимуть незабарвлені головки. Потім обчислюють процент живих (П) за формулою

Ж-100 П = ———, 500

де Ж — кількість незабарвлених живих сперміїв.

Запліднювальну здатність сперміїв оцінюють за ре­зультатами осіменіння здорових самок, визначаючи за­плідненість тварин від першого осіменіння за непроявом повторної охоти протягом двох місяців, методом ректаль­ного досліджування та за результатами одержуваного приплоду. Запліднюваність корів від першого осіменіння повинна становити 50—60, а телиць — 70—80 процентів.

Іноді визначають концентрацію водневих іонів у спермі. Нормальна свіжоодержана сперма бугая і ба­рана має нейтральну (рН 7) або слабкокислу (рН 6,7— 6,9) реакцію, зрушення реакції в лужний бік (рН 7,1 та вище) свідчить про погану якість сперміїв: чим більшим є відхилення в лужний бік, тим менша життєздатність сперміїв. Якщо рН нижче 6,5, то це вказує на значне нагромадження в' спермі молочної кислоти. Нормальна свіжоодержана сперма кнура і жеребця має рН 7,3— 7,6. Зрушення реакції в кислий бік (до рН 6,9—7) свід­чить про дуже добру якість сперми; відхилення реакції в лужний бік до рН 7,8—8 є показником поганої життє­здатності сперміїв.

Нова

Крім згаданого, при мікроскопічному дослідженні сперми можна виявити такі відхилення її якості:

асперматизм (Азм) - відсутність сперми;

олігосперматизм (Озм) - малий об'єм еякуляту;

аспермія (А) - відсутність сперміїв у спермі;

олігоспермія (О) - мала кількість сперміїв у еякуляті;

некроспермія (Н) - мертві спермії;

тератоспермія (Т) - патологічні спермії.

Визначення виживання сперміїв поза організмом самця. Запліднююча здатність сперміїв тісно пов'язана з їх виживанням, що у свою чергу залежить від їх стійкості до зовнішніх впливів. Тому на илемпідприємствах періодично визначають абсолют­ний показник виживання сперміїв кожного плідника. Крім того, цей метод застосову­ють при оцінюванні якості розріджувачів. Існує декілька методів такого тестування. Класичним вважається визначення виживання сперміїв (тривалість збереження рух­ливості сперміїв у годинах) при різних ступенях розрідження (від 2 до 1024) при 37 °С та при 2-А °С до повного відмирання усіх сперміїв.

При цьому беруть 11 чистих сухих стерильних пробірок місткістю 2 мл і в усі з них, окрім першої, вносять по 0,5 мл розріджувача. У першу (порожню) та другу про­бірки вносять по 0,5 мл досліджуваної сперми. Змішують у 2-й пробірці сперму з роз­ріджувачем і переносять з неї 0,5 мл розрідженої сперми у 3-тю пробірку, з неї (після змішування суміші) переносять 0,5 мл у 4-ту пробірку і т. д., щоб отримати серію розріджень: нерозріджена сперма і розріджена у 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 разів. Зразу ж після розрідження беруть з кожної пробірки краплю сперми, оцінюють у ній рухливість сперміїв під мікроскопом при 38-40 °С. Закривають усі пробірки сте­рильними корками і ставлять у холодильник на зберігання при температурі +2-4 °С.

Через кожних 24 години визначають рухливість сперміїв при 38-40 °С з кожної пробірки. Повторюють так кожної доби аж до загибелі усіх сперміїв.

На підставі даних записів визначають за спеціальною формулою абсолютний по­казник виживання та відносний показник виживання сперміїв (розріджена сперма у порівнянні з нерозрідженою).

Сперма бугая та барана доброї якості при розрідженні її у 16-32 рази повинна мати абсолютний показник виживання сперміїв не нижче 1400, кнура - не нижче 900, жеребця - не нижче 400.

При оцінюванні виживання сперміїв за спрощеною формулою визначають на­скільки знижується рухливість сперміїв за період зберігання.

Обчислений таким чином показник зниження рухливості сперміїв у балах у се­редньому на добу зберігання є показником виживання. Якщо рухливість сперміїв зни­зилася всередньому за добу більше ніж на 0,6 бала, то виживання сперміїв добре, при зниженні на 0,6-0,9 бала - задовільне, якщо більше 0,91 - виживання погане.

Нарешті, у практичних умовах виживання сперміїв визначають за проміжком часу (у годинах), протягом якого спермії зберігають прямолінійно-поступальний рух при

Сперма. Фізіологія та біохімія сперми

інкубації їх при +38 °С. Рухливість сперміїв визначають при цьому через кожну годи­ну. Придатною до використання вважають сперму з рухливістю після розморожуван­ня не менше 4-х балів, а після 5-годинного інкубування - не нижче 0,5 бала.

У науковій роботі для оцінювання якості сперми застосовують цілий ряд морфо­логічних, фізіологічних, біохімічних, імунологічних досліджень.

Санітарну оцінку сперми та технологічних процесів, що застосовуються при штучному осіменінні, проводять з використанням методів бактеріології.

Таблиця 11

Мінімальні показники нативної сперми, придатної до використання

Показники	Види тварин
	Бугай	Баран	Кнур	Жеребець
Об'єм еякуляту, мл	3	0,6	150	40
Колір сперми	білувато-жов­туватий	Білий	молочно-білий, сіруватий	сірувато-білий
Запах	свіжого молока	жиропоту	-	-
		сметано- подібна	водяниста з до­	водяниста з до­мішками слизу
Консистенція	вершкоподібна		мішками клей­ких зерен
Концентрація спер­міїв, млрд / мл	0,5	1,0	0,1	0,05
Рухливість сперміїв, бали	8	8	7	5
Виживання у розрі­
дженій спермі при 2-5 °С, відносне,	240	240	200	40
год.
абсолютне, год.	1400	1400	900	450
% патологічних сперміїв, не більше	18	14	20	20
Вміст апатогенних
мікроорганізмів у 1 мл, не більше тис.	5	5	5	5
Колітитр	од	0,1	0,1	0,3
Максимальний % недозрілих сперміїв	2	2	10	10

Усі дослідження сперми проводяться з дотриманням чинних стандартів та ін­струкцій щодо штучного осіменіння тварин.

Проте ні один із застосовуваних у даний час методів не відповідає головній вимозі:

дати швидку відповідь про запліднюючу здатність сперміїв;

не бути громіздким;

тісно корелювати з фактичною запліднюваністю самок.

Визначити точно запліднюючу здатність сперміїв, навіть стосовно певної групи самок, що перебувають у контрольованих умовах утримання, догляду та осіменін- ня, наявними клінічними методами важко тому, що на цей показник впливає багато факторів.

Одні автори вважають, що запліднююча здатність сперміїв становить 70-75 % від першого осіменіння, інші доводять, що у клінічно здорових корів при повноцінному статевому циклі вона становить не менше 90 %, лише у значної частини тварин буває рання ембріональна смертність.

У зв'язку з цим у практиці тваринництва запліднюючу здатність сперміїв оціню­ють за кількістю корів, які не прийшли повторно в охоту через 18-22 та 60-90 днів після осіменіння, а також ректальним дослідженням на тільність. Але в таких ви­падках важко віддиференціювати потенціальні здатності самців від запліднюваності самок. Тобто, на плодючість бугаїв нашаровується здатність корів до запліднення.