Количественное определение энтеробактерий

Количество испытуемого образца			Вероятное количество бактерий в 1 г (мл)
0,1 г (мл)	0,01 г (мл)	0,001 г (мл)
1 мл гомогената	1 мл гомогената в разведении 1:10	1 мл гомогената в разведении 1:100
+	+	+	Более 1000
+	+	-	От 100 до 1000
+		-	От 10 до 100
-	-	-	Менее 10

Обозначения: + наличие роста бактерий; - отсутствие роста бактерий

Количество клеток E.coli в 1 мг (мл) исследуемого лекарственного средства определяют, пользуясь также данной таблицей.

Испытание на наличие Escherichia coli и Salmonella spp.

10 г (мл) образца лекарственного средства вносят в 100 мл пита­тельной среды № 11 (лактозный бульон). В случае если лекарственное средство - жидкость, количество среды уменьшают до 90 мл. Инкубиру­ют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 2-5 ч 10 мл среды № 11 пере­носят в 100 мл среды № 3, перемешивают и инкубируют при температуре (32,5± 2,5) °С в течение 18-24 ч. При отсутствии роста на среде № 3 (сре­да прозрачная, цвет не изменился) считают, что в лекарственном средстве не содержатся бактерии сем. Enterobacteriaceae. При наличии роста испы­тания продолжают.

Испытание на Е. coli

Со среды № 3 делают пересев петлей на среду № 4 (агар Эндо) и инкубируют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 18-24 ч. На среде № 4 Е. coli образуют, как правило, характерные малиновые колонии с ме­таллическим блеском или без него, диаметром 2-4 мм. Подозрительные на принадлежность к Е. coli колонии микроскопируют. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отсевают на скошенную в пробирках среду № 1 и инкубируют при температуре (32,5±2,5)°С в течение 18-24 ч. Из про­бирок с чистой культурой делают пересевы на среды № 14 (агар Симмонса) в № 15 (бульон Хоттингера), а также используют для теста на цитохромокси-дазу. Через 18-24 ч инкубации при (32,5±2,5) °С отмечают бактериальный рост или его отсутствие на средах № 14 и № 15. Утилизацию цитрата уста­навливают по изменению цвета среды № 14 из зеленого в синий. Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности среды № 15 при добавлении реактива Ковача или Эрлиха.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразую-щие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не утилизи­рующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лекарственное средство контаминировано Escherichia coli.

Испытание на виды Salmonella

1 мл обогащенной культуры на среде № 3 вносят в пробирку с 10 мл среды № 12 (селенитовая среда) и инкубируют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 16-18 час. Делают пересев петлей на среду № 5 (висмут-суль­фит агар) и инкубируют при температуре (32,5±2,5) °С в течение 14-18 ч. На среде № 5 Salmonella образует, как правило, типичные черные коло­нии с характерным металлическим блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в черный цвет. Подозрительные на принадлеж­ность к Salmonella колонии микроскопируют и при обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отсевают на среду № 13 (трехсахарный агар с солями железа), нанося большое количество культуры петлей сначала на скошенную часть агара, а потом уколом в столбик. Параллельно ставят тест на цитохромоксидазу, используя чистую культуру со среды № 1. Че­рез 18-24 ч инкубации при температуре (32,5±2,5) °С отмечают измене­ние цвета среды из красного в желтый только в столбике питательной сре­ды. Почернение среды свидетельствует об образовании сероводорода -типичном признаке видов Salmonella.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразую-щие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не фермен­тирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лекарственное средство контаминировано Salmonella.

Выявление и идентификация Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus

Образец препарата вносят в среду № 8 (1:10) и инкубируют 24-48 ч при температуре 30-35°С. После инкубирования пересевают на среды

№ 9 и № 10 в чашки Петри. При отсутствии роста на средах № 9 и № 10 после их инкубирования 24-48 ч делают заключение об отсутствии этих микроорганизмов в препарате.

При наличии на среде № 9 подозрительных на Pseudomonas aeruginosa колоний зеленоватых или серовато-зеленоватых, прозрачных, плоских, с изменением цвета среды в голубовато-зеленоватый и обладаю­щих специфическим запахом, проводят микроскопирование. При обна­ружении грамотрицательных палочек проверяют наличие цитохромокси-дазы.

Если в препарате обнаружены грамотрицательные неспорообразу-ющие палочки, дающие положительную реакцию на цитохромоксидазу и образующие сине-зеленый пигмент, значит в препарате присутствуют бактерии Pseudomonas aeruginosa и препарат к применению не пригоден.

При наличии на среде № 10 золотисто-желтых колоний, образован­ных грамположительными кокками и окруженных желтыми зонами, де­лают вывод о ферментации маннита. Чистую культуру стафилококка про­веряют на наличие фермента плазмокоагулазы.

Если в препарате обнаружены грамположительные кокки, фермен­тирующие маннит и дающие положительную реакцию плазмокоагуляции, значит препарат контаминирован Staphylococcus aureus и к применению не пригоден.

Методы выявления антимикробной активности лекарственных препаратов

Определение антимикробной активности проводят однократно для всей номенклатуры препаратов, выпускаемых на конкретном производ­стве. Некоторые лекарственные препараты обладают выраженным анти­микробным действием в связи с их целевым назначением (для лечения инфекционных заболеваний). К ним относят: антибиотики, препараты, в состав которых введены антибиотики и химиотерапевтические препа­раты: сульфаниламиды, нитрофурановые, производные 8-оксихинолина, соли тяжелых металлов, производные фторхинолона и некоторые другие. Кроме того существует ряд лекарственных средств, способных оказывать неспецифическое антимикробное действие: кислоты (например, ацетил­салициловая кислота), щелочи, спирты, окислители, препараты, содержа­щие серу, фитонциды, эфирные масла, витамины, анальгетики и др.

В основе метода определения антимикробного действия лежит срав­нение интенсивности роста тест-микроорганизмов в присутствии и в от­сутствие препарата. В качестве тест-микроорганизмов используют опре­деленные штаммы Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans и Aspergillus niger. Заключение об отсутствии антимикробного действия делают при наблюдении одинаковой интенсивности роста всех культур в опытном и контрольном посевах.

Способы устранения антимикробного действия ле­карственных средств

Для НЛС рекомендованы такие методы:

увеличение рабочего разбавления препарата (за счет большого объе­ма фосфатного буферного раствора);

добавление специфических инактиваторов (например, пеницилли-назы для b-лактамных антибиотиков) или веществ, замещающих антиме­таболит (например, парааминобензойной кислоты для сульфаниламидов);

использование неспецифических инактиваторов-нейтрализаторов, особенно для препаратов с консервантами, например, 0,3-0,4 % раствор твина-80 и твина-20; 0,1-0,5 % раствор соевого лецитина, гистидина, ко­торые предварительно вносят в питательную среду.

Если все перечисленные методы неэффективны, а лекарственное вещество растворимо, то используют метод мембранной фильтрации.