2. Микроорганизмы, контролируемые в нлс

Выбор микроорганизмов, нормирование которых предусмотрено Фар­макопеей (табл. 27), определяется их опасностью для здоровья населения и способностью служить критерием оценки гигиенического состояния про­изводства, предусмотренного GMP. Этот выбор достаточно ограничен по эко­номическим соображениям, но в настоящее время признан достаточным для получения результатов, адекватно отражающих качество продукции по мик­робиологическим показателям, и со временем может быть расширен. Напри мер, существует мнение, что в воде, используемой при изготовлении несте­рильных офтальмологических препаратов, должны отсутствовать псевдомо­нады, не только P.aeruginosa, но и P. (Burkholderia) cepacia.­

Однако существу­ющие методы анализа (посев на цетрамидный агар) исключают выделение и идентификацию последнего вида. В фармацевтической микробиологии об­суждается вопрос о некультивируемых видах микроорганизмов, определе­ние которых в настоящее время не предусмотрено. Известно значение бакте­риальной биопленки, вызывающей загрязнение системы водоснабжения и служащей резервуаром патогенных бактерий, попадающих в питьевую воду, системы гемодиализа, госпитальные системы водоснабжения и др. В отно­шении экологии водоснабжения фармацевтического производства этот воп­рос пока не рассматривается при существующей необходимости изменить критерии микробиологической оценки качества воды.

Микробиологическая чистота готовых лекарственных средств

Табл.27.

Категория	Препараты	Рекомендуемые требования
1	Лекарственные препараты, к которым предъявляется требование «стерильность»	Препараты должны быть стериль­ными
2	• Для применения местно, наружно, интравагиналь-но • Для введения в полости уха, носа • Для введения в дыха­тельные пути • Трансдермальные пла­стыри За исключением тех лекар­ственных препаратов, ко­торые должны быть сте­рильными	• Общее число аэробных бактерий и грибов суммарно - не более 102 в 1 г или в 1 мл, или на 1 пла­стырь (включая клейкую сторону и основу) • Отсутствие энтеробактерий и некоторых других грамотрица-тельных бактерий на 1 пластырь (включая клейкую сторону и ос­нову) • Не более 101 энтеробактерий и некоторых других грамотрица-тельных бактерий в 1 г или 1 мл для других препаратов • Отсутствие Pseudomonas aerugi­nosa в 1 г или в 1 мл, или на 1 пластырь (включая клейкую сторону и основу) Отсутствие Staphylococcus aureus в 1 г или в 1 мл, или на 1 пластырь (включая клейкую сторону и основу)

В последующих разделах этой главы будут рассмотрены морфолого-биохимические особенности микроорганизмов (в порядке их перечис­ления в Определителе бактерий Берджи), содержание которых регламен­тировано для продукции фармацевтической промышленности, в связи с существующими методами их выделения и идентификации, а также их значение в паталогии человека.

Грамотрицательные аэробные (микроаэрофильные палочки)

Род Pseudomonas. Прямые или слегка изогнутые, но не спираль­ные палочки 0,5-1,0 х 1,5-5,0 мкм. Подвижны (полярные жгутики). Аэро­бы. Способны к анаэробному дыханию с использованием нитрата в каче­стве акцептора электронов. Некоторые виды - факультативные автотро-фы. Род включает более 70 видов. Они широко распространены в приро­де. Некоторые виды патогенны для человека, животных и растений могут загрязнять фармацевтические препараты, размножаться в растворах ан­тисептиков. На основании гомологии ДНК некоторые виды, относивши­еся к роду Pseudomonas, выделены в род Burkholderia (В.mallei, B.pseudomallei, В.cepacia), род Brevundimonas (B.diminuta) и др.)

Pseudomonas aeruginosa - основной возбудитель гнойно-воспали­тельных процессов, особенно в условиях стационаров. Вызывает общие и местные нагноительные процессы: отиты, пиелиты, циститы, кератиты, менингоэнцефалиты, инфицирует поверхности ран и ожогов. Устойчива к действию антибиотиков. Описаны вспышки токсикоинфекции вслед­ствие употребления пищевых продуктов (мясо, рыба), контаминирован-ных этим микроорганизмом. Образует биопленку на оборудовании систе­мы водоснабжения. Способна разрушать многие химические вещества, в том числе биоциды.

Растет на простых питательных средах в широком диапазоне темпе­ратур (4-42 °С), оптимальная температура 37 °С. Строгий аэроб. На жид­ких средах (пептонная вода, МПБ) образует характерную серовато-сереб­ристую пленку, по мере старения культуры возникает помутнение. На плот­ных средах (МПА, кровяной агар, среды Эндо, Левина, Плоскирова) вид колоний зависит от состава среды. На специальных средах образует сине­вато-зеленоватые пигменты (пиоцианин, флюоресцеин и др.), выделяю­щиеся в питательную среду. Имеются также непигментированные штам­мы. Образует токсины и другие факторы вирулентности.

Pseudomonas (Burkholderia) cepacia - повсеместно распространен­ный микроорганизм, часто контаминирует растворы для местной анесте­зии, лекарственные препараты, косметические средства. Эпидемиология и этология имеет много общего с таковыми P. aeruqinosa. Подвижная по­лиморфная палочка, по Граму окрашивается биполярно. Температурный оптимум 30 °С. Выделение требует специальных селективных сред. На кровяном огаре с полимиксином образует мутные маслянистые беловато-серые колонии. Возможно образование желтого или зеленоватого нефлю-оресцирующего феназинового пигмента, растворимого в хлороформе.

Семейство Enterobacteriaceae

Семейство Enterobacteriaceae включает более 115 видов, принадле­жащих к 30 родам:. Это прямые палочки 0,3-1,8 мкм. Подвижные (перит-рихи) или неподвижные. Присутствуют повсеместно: в почве, воде, на растениях, у животных. Некоторые из них патогенны и вызывают заболе­вания желудочно- кишечных, дыхательных и мочевыводящих путей, ме­нингиты и раневые инфекции. Около 50 % внутрибольничньгх инфекций вызываются видами этого семейства. Наиболее часто встречаются Escherichia coli, Serratia marcescens и виды родов Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Shigella.

Pod Escherichia. Прямые палочки 1,1—1,5 г 2,0-6,0 мкм одиночные или в парах. Для многих штаммов характерны капсулы или микрокапсулы.

Виды рода Escherichia различаются по подвижности и биохимичес­кой активности.

Escherichia coli и колиформные бактерии

Е. coli - постоянный обитатель и важный представитель нормаль­ной микробиоты кишечника человека и теплокровных животных. Боль­шая часть штаммов E.coli не считается патогенной, однако вид включает условно-патогенные и патогенные штаммы. Последние различаются по факторам вирулентности, которыми они обладают (энтеротоксигенные, энтеропатогенные, энтерогеморратические и др.)

В 1892 г. Shardinger предложил использовать Е. coli как санитарно-показательный микроорганизм.

По фенотипическим признакам Е. coli имеет много общего с други­ми родами сем. Enterobacteriaceae (Klebsiella, Citrobacter и Enterobacter), поэтому было предложено эту группу бактерий называть колиформными. Этот термин не является таксономическим, но служит рабочим определе­нием группы грамотрицательных факультативно анаэробных палочковид­ных бактерий, которые ферментируют лактозу с образованием кислоты и газа за 48 ч культивирования при 35 °С.

Некоторые колиформные бактерии способны обитать во внешней среде, поэтому группу санитарно-показательных колиформных бактерий было предложено называть фекальными колиформами. Фекальные коли­формы рассматривают как представителей общих колиформ, которые ра­стут и ферментируют лактозу при повышенной температуре инкубации (термотолерантные колиформы). Эта группа включает в основном Е. coli; однако виды Klebsiella также способны ферментировать лактозу при тем­пературе 44-45 °С. Для дифференциации E.coli и Klebsiella spp. служат специальные методы.

Показатель общего числа колиформ используют в качестве индикато­ра санитарного состояния воды или как основной индикатор санитарного состояния производства в пищевой и фармацевтической промышленности; показатель термотолерантных колиформ - для характеристики санитарно­го состояния воды; E.coli - показатель свежего фекального загрязнения.

Род Citrobacter. Прямые палочки 1 х 2-6 мкм, одиночные и в парах, обычно подвижные. Факультативные анаэробы. Обнаружены в почве, воде и пищевых продуктах, входят в состав нормальной микробиоты кишеч­ника. Штаммы определенных серогрупп вызывают гастроэнтериты и пи­щевые токсикоинфекции, оппортунистические и госпитальные инфекции.

Род Enterobacter. Прямые палочки 0,6-1, х 1,2-3,0 мкм. Подвиж­ные. Оптимальный диапазон температуры 30-37 °С. Вызывает внутри-больничные и опортунистические инфекции.

Род Klebsiella. Прямые палочки 0,3-1,0 х 0,6-6,0 мкм, одиночные, в парах или коротких цепочках. Неподвижные. Для К. pneumoniae и К. oxytoca характерна массивная полисахаридная капсула, определяющая об­разование крупных мукоидных колоний. Известно более 80 капсульных антигенов, используемых для серотипирования клебсиелл. Широко рас­пространены, встречаются в почве, воде, на фруктах и овощах.

Температурные границы роста 12—43 °С, оптимум рН 7,2.

Вызывают оппортунистические и внутрибольничные инфекции.

К.pneumoniae образует экзотоксин. Является возбудителем бронхо-легочных заболеваний, иногда - менингита; у детей может вызывать сеп­тицемию, циститы и другие заболевания.

К. ozaenae - возбудитель хронического заболевания респираторно­го тракта.

К. rhinoscleromatis вызывает хронический гранулематозный или ат-рофический процессы в слизистой оболочке верхних дыхательных путей.

Род Мorganella. Прямые палочки 0,6-0,7 х 1,0-1,7 мкм. Подвижны (перитрих). Роение отсутствует. Выделяются из фекалий млекопитающих. Вызывают оппортунистические инфекции.

Род Proteus. Прямые палочки 0,4-0,8 х 1-3 мкм. Подвижные (пе­ритрих). У большинства штаммов имеет место роение с периодическими циклами миграции, приводящее к образованию концентрических зон или распространению в виде однородной пленки по влажной поверхности среды. Встречаются в кишечнике позвоночных, в почве, навозе, загряз­ненных водах. Вызывают инфекции мочевых путей, вторичные пораже­ния, часто при ожогах.

Род Providencia. Прямые палочки 0,6-0,8 х 1,5-2,5 мкм, подвиж­ные (перитрих), роение отсутствует. Вызывают желудочно-кишечные рас­стройства, инфекции мочевых путей, вторичные поражения при ранах и ожогах

Род Salmonella. Прямые палочки 0,7-1,5 х 2-5 мкм. Подвижны (пе­ритрих). Встречаются у человека и животных, в пищевых продуктах и в природной среде. Вызывают брюшной тиф, кишечные инфекции, ток-сикоинфекции, септицемию. Образуют эндоксины.

Температурный оптимум 35-37 °С. Диапазон рН 4,1-9,0. Оптимум 7,2-7,4. Рост подавляют или ограничивают высокие концентрации соли и сахара.

Биохимические свойства могут различаться даже в пределах одного серовара.

Род Serratia. Прямые палочки 0,5-0,8 х 0,9-2 мкм. Обычно под­вижные (перитрих). Некоторые виды образуют розово-красный водоне-растворимый пигмент продигнозин. Распространены повсеместно (вода, почва, растения). S.marcescens вызывает оппортунистические инфекции -септицемию, инфекции мочевых путей, мастит у коров.

Род Shigella. Прямые палочки, неподвижны. По морфологическим признакам не отличаются от других представителей сем. Enterobacteriaceae. Вызывают дизентерию и другие шигеллезы - заболевания, передающие­ся с водой и пищей, распространенные среди приматов, включая челове­ка. По биохимическим признакам шигеллы трудно дифференцировать от Е. coli. На основании гомологиии ДНК их можно отнести к одному виду. S. dysenteriae продуцирует экзотоксин, обладающий выраженным тропиз­мом к нервной системе и слизистой оболочке кишечника. Другие виды шигелл образуют эндотоксины. Вызывают дизентерию.

Род Yersinia. Прямые палочки 0,5-0,8 х 1-3 мкм, приобретающие иногда сферическую форму. Подвижные (перитрих) или неподвижные (Y. pestis). Подвижность и метаболизм зависит от температуры. Темпера­турные пределы роста - 0-39 °С, для Y.pestis - до 45 °С; оптимум роста 28-30 °С; оптимум рН 6,9-7,2. Широко распространены в природе, пара­зиты животных и человека, йерсиниозы - опасные инфекционные забо­левания.

Грамположительные кокки

У большинства организмов этой группы клетки сферические, иног­да овальные, всегда четко грамположительные, неподвижные.

Род Enterococcus. Род Enterococcus представлен видами, ранее относи­мыми к роду Streptococcus (S.f aecalis, S. faecium, S. avium, S. gallinarum и др.)

Клетки сферические или овальные 0,6-2,0 х 0,6-2,5 мкм в парах или (в жидкой среде) коротких цепочках. Факультативные анаэробы. Сбра­живают разнообразные углеводы с образованием лактата. Нуждаются в сложных питательных средах. Каталазоотрицательные. Растут в преде­лах температуры 10—45 °С, оптимальная температура 37 °С. Растут при рН 9,6, концентрации NaCl 6,5 %, желчи - 40 %. Как правило, относятся к серологической группе Lancefield D. Широко распространены в приро­де, обитают в кишечнике позвоночных, иногда вызывают пиогенные ин­фекции.

Все виды и варианты энтерококков признаны санитарно-показатель-ными микроорганизмами и отвечают предъявляемым к ним требованиям. Это постоянные обитатели кишечника несмотря на то, что их количе­ство меньше, чем E.coli; они не способны размножаться во внешней среде (точнее могут размножаться при содержании органических веществ 375 мкг/л и температуре равной 20 °С и выше). Не проявляют выражен­ной изменчивости во внешней среде, что облегчает их распознавание и не имеют аналогов во внешней среде. Отмирают во внешней среде значи­тельно раньше, чем E.coli, поэтому всегда свидетельствуют о свежем фе­кальном загрязнении. Самым главным достоинством является их устой­чивость к неблагоприятным внешним воздействиям. Они устойчивы к нагреванию до 65 °С в течение 30 мин, что делает их показателем каче­ства режима пастеризации. Энтерококки устойчивы к высоким концент­рациям NaCl (6,5-17 %), что позволяет использовать их при анализе мор­ской воды. Энтерококки устойчивы в диапазоне рН 3-12, что можно ис­пользовать при анализе стоков кислого и щелочного характера.

В настоящее время количественная энтерококкометрия принята меж­дународным стандартом по воде как дополнительный показатель фекаль­ного загрязнения, а при выявлении атипичных E.coli - главным методом выявления фекального загрязнения.

Трудности в индикации энтерококков состоят в необходимости ис­пользовать среды сложного состава и в том, что для их выявления требу­ется больше времени, чем для колиформных бактерий.

Род Staphylococcus. Повсеместно распространенные микроорганиз­мы, чувствительны к нагреванию и действию биоцидов. Поэтому их при­сутствие в помещении свидетельствует о плохом санитарном состоянии.

Стафилококки образуют клетки диаметром 0,5-1,5 мкм, располага­ющиеся в мазках одиночно, парами или гроздьями. Факультативные ана­эробы, каталазоположительны, оксидазоотрицательны, чувствительны к действию лизостафина, но не лизоцима, растут на средах с 5-10 % NaCl. На плотных средах образуют мутные, круглые колонии желтого, кремо­вого или оранжевого цвета. На жидких средах вызывают помутнение и рыхлый осадок. Разжижают желатин, образуют H₂S. Восстанавливают нитраты до нитритов.

Staphylococcus aureus вызывает разнообразные гнойно-септические инфекции и пищевые отравления. S.aureus коагулирует плазму, что явля­ется критерием для идентификации этого вида.

Дрожжи и плесневые грибы

Грибы - многочисленная группа эукариотических микроорганизмов, различающихся по своей морфологии и физиологии. В основном сапрот-рофы, некоторые виды вызывают заболевания человека и животных (ми­козы). Поселяясь на разнообразных продуктах - пищевом и лекарствен­ном сырье, пищевых продуктах, кормах, лекарственных препаратах они вызывают их порчу и могут выделять в среду опасные микотоксины. Кон­такт с материалом, инфицированном грибами, может привести к разви­тию заболеваний, в том числе аллергических. Подробно материал изло­жен в главе 2.