8) Особенности регуляции активности генов у эукариот. Альтернативный сплайсинг. Этапы транскрипции и трансляции. Роль малых рнк. Рнк- интерференция.

Регуляция генов у эукариот протекает намного сложнее, чем у прокариот. Различные типы клеток многоклеточного эукариотического организма синтезируют ряд одинаковых белков и в то же время они отличаются друг от друга набором белков, специфичных для клеток данного типа. Уровень продукции зависит от типа клеток, а также от стадии развития организма. Регуляция экспрессии генов осуществляется на уровне клетки и на уровне организма.  Гены эукариотических клеток делятся на два основных вида: первый определяет универсальность клеточных функций, второй – детерминирует (определяет) специализированные клеточные функции. Функции генов первой группы проявляются во всех клетках. Для осуществления дифференцированных функций специализированные клетки должны экспрессировать определенный набор генов.  Хромосомы, гены и опероны эукариотических клеток имеют ряд структурно-функциональных особенностей, что объясняет сложность экспрессии генов.  1. Опероны эукариотических клеток имеют несколько генов - регуляторов, которые могут располагаться в разных хромосомах.  2. Структурные гены, контролирующие синтез ферментов одного биохимического процесса, могут быть сосредоточены в нескольких оперонах, расположенных не только в одной молекуле ДНК, но и в нескольких.  3. Сложная последовательность молекулы ДНК. Имеются информативные и неинформативные участки, уникальные и многократно повторяющиеся информативные последовательности нуклеотидов.  4. Эукариотические гены состоят из экзонов и интронов, причем созревание и-РНК сопровождается вырезанием интронов из соответствующих первичных РНК-транскриптов (про-и-РНК), т.е. сплайсингом.  5. Процесс транскрипции генов зависит от состояния хроматина. Локальная компактизация ДНК полностью блокирует синтез РНК.  6. Транскрипция в эукариотических клетках не всегда сопряжена с трансляцией. Синтезированная и-РНК может длительное время сохраняться в виде информосом. Транскрипция и трансляция происходят в разных компартментах.  7. Некоторые гены эукариот имеют непостоянную локализацию (лабильные гены или транспозоны).  8. Методы молекулярной биологии выявили тормозящее действие белков-гистонов на синтез и-РНК.  9. В процессе развития и дифференцировки органов активность генов зависит от гормонов, циркулирующих в организме и вызывающих специфические реакции в определенных клетках. У млекопитающих важное значение имеет действие половых гормонов.  10. У эукариот на каждом этапе онтогенеза экспрессировано 5-10% генов, остальные должны быть заблокированы.

Альтернативный сплайсинг — процесс, позволяющий одному гену производить несколько мРНК и, соответственно, белков. Большинство генов в эукариотических геномах содержат экзоны и интроны. После транскрипции в процессе сплайсинга интроны удаляются из пре-мРНК. А вот экзон может включаться (или нет) в состав конечного транскрипта. Таким образом, с помощью альтернативного сплайсинга можно получить множество транскриптов, а, следовательно, и белков.

Существует несколько механизмов альтернативного сплайсинга:

Пропуск экзона или экзонной кассеты: в этом случае экзон может вырезаться из первичного транскрипта или сохраняться в нём. Это наиболее часто используемый механизм у млекопитающих.

Взаимоисключающие экзоны: из двух экзонов в конечном транскрипте сохраняется только один.

Использование альтернативного донорного сайта: есть несколько альтернативных 5'-участковсплайсинга (донорных сайтов), что изменяет 3'-границу вышележащего экзона.

Использование альтернативного акцепторного сайта: используются разные 3'-участкисплайсинга (акцепторные сайты), что меняет 5'-границы нижележащего экзона.

Удержание интрона: интрон сохраняется в последовательности транскрипта. Если интрон находится в кодирующей последовательности, то он может кодировать стоп-кодон или же сдвигать рамку считывания. А это может привести к потере функциональности белка, поэтому данный механизм альтернативного сплайсинга используется крайне редко у млекопитающих.

Существуют различные способы регуляции альтернативного сплайсинга: РНК-белковые взаимодействия, РНК-РНК взаимодействия (при взаимоисключающих экзонах), взаимодействие пре-мРНК с некодирующими РНК, в том числе малыми ядрышковыми РНК и др. Несмотря на столь потенциальное разнообразие регуляторных механизмов, РНК-белковые взаимодействия считаются основными способами регуляции сплайсинга.

Транскрипция (переписывание) — процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы, происходящий во всех живых клетках. Другими словами, это перенос генетической информации с ДНК на РНК.

Различают три этапа транскрипции: инициацию, элон­гацию и терминацию.

         Инициация. Последовательность ДНК, транскриби­рующаяся в одну иРНК, начинающаяся промотором на 5'-конце и заканчивающаяся терминатором на 3'-конце, является единицей транскрипции и соответствует совре­менному понятию «ген». Контроль экспрессии генов может осуществляться на этапе инициации транскрипции. На этом этапе РНК-полимераза распознает промотор — фрагмент длиной 41-44 п.н. Транскрипция ДНК происходит в направлении 5'—3', или слева направо. Предполагается, что последовательность ТАТА контролирует выбор стартового нуклеотида, а ЦААТ — первичное связывание РНК-полимеразы с ДНК-матрицей.

         Элонгация. Стадия элонгации иРНК имеет ряд ана­логий с элонгацией ДНК. В качестве предшественников для нее необходимы рибонуклеозидтрифосфаты. Этап элонгации транскрипции, т.е. рост цепи иРНК, происходит путем присоединения рибонуклеозидмонофосфатов к 3'-концу цепи с одновременным освобождением пирофосфата. Копирование у эукариот обычно осуществляется на ограниченном участке ДНК (т.е. в пределах гена), хотя у прокариот в ряде случаев транскрипция может проходить последовательно через несколько сцепленных генов (цистронов), формирующих единый оперон, и с одного общего промотора. В таком случае образуется полицистронная иРНК.

         Терминация. Транскрипция завершается в специфи­ческом участке ДНК, содержащем терминирующую по­следовательность. В клетках Е. сoli выявлен особый белок (ро-фактор), повышающий точность терминации. Белок присоединяется к 5'-концу растущей иРНК и продви­гается по ней, постепенно приближаясь к ДНК и как бы преследуя РНК-полимеразу. В момент, когда РНК-полиме­раза останавливается в сайте-терминаторе, фермент захватывается ро-фактором и сбрасывается с ДНК. Терминатор содержит особую последовательность основа­ний, прочитывающуюся одинаково в обеих цепях ДНК, но в противоположных направлениях. Например, 5'  ЦЦА    ТГГ  3'  3'  ГГТ     АЦЦ 5'

Трансляция — процесс синтеза белка из аминокислот на матрице информационно (матричной) РНК (иРНК, мРНК), осуществляемый рибосомой.

Процесс трансляции подразделяют на три стадии: ини­циацию, элонгацию и терминацию. 

Инициация: включает все реакции, осуществляющиеся до формирова­ния пептидной связи между первыми двумя аминокисло­тами. У Е. coli от инициации транскрипции гена до появле­ния в клетке  его  иРНК  проходит  ≈ 2,5 мин, а соответствую­щего белка — еще ≈ 30с. Инициация синтеза полипептидной цепи происходит в момент формирования комплекса между иРНК, 30S субъединицей рибосомы и формилметионил-тРНК.

         Элонгация: включает все реакции от момента образования первой пептидной связи до присоединения к синтезирующемуся полипептиду последней аминокисло­ты. У прокариот этап элонгации идет очень быстро; как отмечалось, при 37 °С в полипептид за 1 с включается в среднем 15 аминокислот. Следовательно, если исходить из того, что средний размер гена составляет 1000 п.н., синтез кодируемого им белка из 300 аминокислот осуществляется всего за 20с. При этом в синтезе белка участвует одновре­менно до 80% всех клеточных рибосом. У эукариот скорость синтеза белка существенно ниже: за 1 с при 37 °С в цепь включаются лишь ≈ 5 аминокислот.

Терминация: трансляции полностью синтезированный поли­пептид освобождается от концевой тРНК, а рибосомы отходят от иРНК.

         Сформировавшийся в ходе трансляции полипептид полностью соответствует (колинеарен) кодирующему его гену.

Малые ядерные РНК: Обнаруживаются в ядре, всегда связаны с белками, формируя малые ядерные рибонуклеопротеиновые частицы (snurp).Содержат большое количество уридина (U1,U2, …U12). Размер от 90-300 нуклеотидов. Транскрибируются РНК pol II или РНК pol III. 5’-конец имеет триметилированный кэп (по N7 и дважды по N2 гуанозина).

Функции:

- Участвуют в процессинге пре-мРНК.

- Расщепление полицистронных мРНК.

- Поддержание целостности теломер.

- Регуляция транскрипции.

РНК-интерференция - процесс подавления экспрессии гена на стадии транскрипции, трансляции, деаденилирования или деградации мРНК при помощи малых молекул РНК.

Процессы РНК-интерференции обнаружены в клетках многих эукариот: у животных, растений и грибов. Система РНК-интерференции играет важную роль в защите клеток от вирусов, паразитирующих генов (транспозонов), а также в регуляции развития, дифференцировки и экспрессии генов организма.