4. Дифференциальная диагностика возбудителей и оценка результатов

4.1. Пироплазмид дифференцируют между собой по их форме, углу со-

единения парных грушевидных форм, соотношению их размера к радиусу

эритроцита, локализации в эритроците, а также от анаплазм и эперитрозоон.

При определении пользуются следующей таблицей:

Возбудитель	Форма	Размер парных грушевидных форм по отно- шению к ра- диусу эритро- цита		Угол со- единения парных грушевид- ных форм			Локализация
1	2	3		4			5
Piroplasma (Babesia) caballi	Овальная, кольцевидная, круглая, амебо- видная, груше- видная	Больше		Острый			В центре эрит- роцитов
Nuttallia (Babesia) equi	Овальная, кольцевидная, грушевидная, крестовидная	Меньше, равны		-			Чаще в центре эритроцитов, клетках лим- фоидной ткани
Babesia (Francaiella) bovis	Кольцевидная, амебовидная, грушевидная	Равны		Тупой			В центре эрит- роцитов
Piroplasma (Babesia) bigeminum	Кольцевидная, овальная, аме- бовидная, гру- шевидная	Больше		Острый			В центре эрит- роцитов
Babesia divergens	Круглая, аме- бовидная, гру- шевидная	Меньше		Острый			По периферии эритроцитов
Piroplasma ovis (В. motasi)	Круглая, овальная, аме- бовидная,гру- шевидная		Больше		острый	В центре эрит- роцитов
Babesia ovis	Круглая, коль- цевидная,гру- шевидная		Меньше		тупой	В центре эрит- роцитов
Piroplasma (Babesia) canis	Кольцевидная, овальная, аме- бовидная, гру- шевидная		Больше		острый	В центре эрит- роцитов
Theileria annulata	Круглая, запя- товидная, овальная		Равны, меньше		-	В эритроцитах, клетках лим- фоидной ткани
Theileria sergenti	Палочковид- ная, запятовид- ная, овальная, грушевидная		Равны, меньше		-	В эритроцитах, клетках лим- фоидной ткани
Theileria ovis	Круглая, овальная, па- лочковидная, запятовидная		Меньше		-	В эритроцитах, клетках лим- фоидной ткани
Anaplasma marginale	Круглая, в виде точки		-		-	Чаще по пери- ферии, реже в центре эритро- цитов
Anaplasma ovis	Круглая, в виде точки		-		-	Чаще по пери- ферии, реже в центре эритро- цитов
Eperythrozoon wenyoni	Круглая, овальная, па- лочковидная, гантелевидная, кольцевидная		-		-	На поверхно- сти эритроци- тов, тромбоци- тов, в плазме крови
Eperythrozoon ovis	Круглая, овальная, па- лочковидная, гантелевидная, кольцевидная		-		-	На поверхно- сти эритроци- тов, тромбоци- тов, в плазме крови

Продолжение

4.2. Результат исследования считают положительным при обнаружении в

препарате из исходного материала возбудителей пироплазмидозов.

4.3. В сомнительных случаях при диагностике пироплазмидозов лошадей

ставят РДСК с нутталлийным антигеном ВИЭВ. 

5. Постановка и учет реакции длительного связывания

комплемента (РДСК) с нутталлийным антигеном ВИЭВ

5.1. Реакция длительного связывания комплемента (РДСК) применяется

для выяснения эпизоотического состояния хозяйств по пироплазмидозам лоша-

дей, при необходимости постановки диагноза на нутталлио-, бабезионоситель-

ство.

5.2. Реакцию ставят в объеме 0,5 мл (по 0,1 мл каждого компонента) в

пробирках 10-12х120 мм.

5.3. Компоненты реакции:

- антиген (лиофилизированный) с наполнителем из сахарозы и карбокси-

метилцеллюлозы. Имеет вид пористой таблетки, хорошо растворим в физиоло-

гическом растворе, хранится при +2+4°С. Используют в рабочем титре, указан-

ном на этикетке ампулы;

- испытуемые и контрольные (пироплазмидозная и нормальная) сыворот-

ки лошадей в разведении 1:5, инактивированные при 58-59°С в течение 30 ми-

нут в день постановки реакции;

- комплемент — сыворотка морской свинки (свежая или лиофилизирован-

ная);

- гемолитическая сыворотка - гемолизин, выпускаемый биопромышлен-

ностью. В реакции используют тройной титр гемолизина;

- эритроциты барана, отмытые 3-кратно физиологическим раствором пу-

тем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Из осадка готовят

2%-ную взвесь в физиологическом растворе.

Перед постановкой реакции взвесь эритроцитов и гемолизин, разведен-

ный в тройном титре, смешивают в равных объемах (гемолитическая система) и

смесь выдерживают 20 минут при температуре 37°С для сенсибилизации эрит-

роцитов.

Титрование комплемента

Нативный комплемент перед титрованием разводят 1:30 (0,1 мл + 2,9 мл

физиологического раствора). Сухой комплемент разводят 1:20 (0,1 мл компле-

мента + 1,9 мл физиологического раствора).

Титрование проводят в гемолитической системе:

Компоненты	№№ пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Комплемент в раз- ведении 1:30(1:20)	0,01	0,02	0,03	0,04	0,05	0,06	0,07	0,08	0,09	0,1
Физиологический раствор (0,85%)	0,29	0,28	0,27	0,26	0,25	0,24	0,23	0,22	0,21	0,2
Гемолитическая система	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Водяная баня при 37-38 гр.С - 10-15 минут
Результат	НГ	НГ	ЧГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ

Примечание: НГ - нет гемолиза; ЧГ - частичный гемолиз; ПГ - полный гемолиз.

Примечание: Для удобства в работе и более точной дозировки вначале рекомендуется приго-

товить необходимые разведения комплемента в 10- кратных объемах в отдельных пробирках.

Для этого в дополнительный ряд пробирок вносят комплемент разведенный 1:20 (1:30) в до-

зах 0.1: 0.2; 0,3 и т.д. до 1 мл, и добавляют в каждую пробирку недостающее до 3 мл соответ-

ственно 2,9: 2.8; 2,7; и т.д. Из первой пробирки этого ряда переносят по 0,3 мл жидкости в

первую пробирку, из второй - во вторую соответственно и т.д. Эту работу можно выполнять

аппаратом Флоринского.

Титром является наименьшее количество разведенного 1:30 (1:20) ком-

племента, который дает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере

титр равен 0,04. Для реакции берут 2 дозы, т.е. 0,08.

Расчет количества комплемента, необходимого для главного опыта, де-

лают по формуле:

АхБ

------ = Х,

  В

где А - рабочая доза комплемента, Б - количество пробирок в реакции, В - раз-

ведение комплемента, Х - количество чистого комплемента.

Пример: 0,08х100:20=0,4. Так как общий объем разведенного комплемен-

та. необходимого для 100 пробирок, равен 10 мл (100х0,1 мл), то к 0,4 мл чис-

того комплемента следует добавить 9,6 мл физиологического раствора.

Главный опыт

Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1:5 с антигеном и без

антигена.

Для контроля в реакцию берут 2 позитивные (пироплазменные или нут-

таллийные) и 2 негативные (нормальные) сыворотки в разведении 1:5. Одно-

временно ставят контроль антигена на антикомплементарность (антигена 0,2 мл

- комплемента 0,1 мл - гемолизина 0,2 мл) и на гемотоксичность (антигена 0.1

мл ⁴- физиологического раствора 0,2 мл + 0,2 мл гемолитической системы).

Схема главного опыта:

Компоненты реакции	Пробирки для каждой сыворотки	Контроль антигена	Контроль гемолитической системы
	1	ч
Испытуемая сыворотка	0,1 0,1 0,1	0,1 0,1 0,1	0,2 0,1
Физиологиче- ский раствор (0,85%)
Антиген в ра- бочем титре
Комплемент 1:30 (или 1:20)

После чего пробирки ставят в холодильник при температуре 2-4°С на 18-20

часов, а затем на 30 минут при комнатной температуре,

Гемолитиче- 0,2 0,2 0,2 0,2

екая система

Водяная баня при 37-38°С - 10-15 минут, в зависимости от прохождения

контролей. Холодильник при 2-4°С - на 4-5 часов или на другой день - при ус-

ловии хранения в холодильнике,

Примечание: позитивные и негативные сыворотки (контроли) испытывают по схеме главно-

го опыта.

Учет реакции начинают с контролей: в испытуемых сыворотках без анти-

гена (2-й ряд), в заведомо отрицательных сыворотках и контроле на антиком-

плементарность антигена должен быть полный гемолиз; в заведомо положи-

тельных сыворотках и контроле гемосистемы - полная задержка гемолиза. По-

сле проверки контролей учитывают результаты реакции с испытуемыми сыво-

ротками. Степень задержки гемолиза эритроцитов отмечают крестами и оцени-

вают:

++++ - гемолиз отсутствует - реакция положительная,

+++ - 25% гемолиза - реакция положительная.

++ - 50% гемолиза - реакция положительная,

+ - 75% гемолиза -реакция сомнительная,

- - 100% гемолиза реакция отрицательная.