Лабораторная работа Количественное определение макроэргических соединений в мышцах (атф и креатинфосфат)

В мышечной ткани содержится два макроэргических соединения: АТФ и креатинфосфат. Они обеспечивают мышцу по мере надобности большим количеством энергии.

Основной путь образования АТФ в тканях – окислительное фосфорилирование в процессе тканевого дыхания. Креатинфосфат образуется при участии АТФ в состоянии покоя и служит резервом высокоэргического фосфата для синтеза АТФ из AДФ при активной мышечной работе.

Принцип метода. Метод определения макроэргических соединений в мышцах основан на том, что два последних остатка фосфорной кислоты в АТФ, богатые энергией, как и фосфатный остаток в креатинфосфате, легко отщепляются при непродолжительном гидролизе в кислой среде (так называемый лабильно связанный фосфор). Сравнение содержания неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза дает представление о количестве лабильно связанного фосфора, которое приходится на долю макроэргических соединений мышечной ткани. Количество фосфора определяют по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.

Ход работы. Тщательно измельченную мышечную кашицу в количестве 5 г помещают в мерную колбу на 100 мл, стоящую на ледяной бане, и добавляют в нее 50 мл охлажденного 2,5%-ного раствора ТХУ. Содержимое пробирки активно перемешивают для экстрагирования АТФ и креатинфосфата в течение 5 мин. Экстракт фильтруют в мерную колбу на 100 мл, стоящую на ледяной бане. К остатку мышечной кашицы приливают 40 мл дистиллированной воды и продолжают экстракцию на холоде в течение 5 минут. Полученный водный экстракт после фильтрования добавляют к экстракту с ТХУ, доводя общий объем до 100 мл дистиллированной водой.

В две термостойкие колбы – контрольную и опытную – с помощью пипетки Мора наливают по 5 мл полученного безбелкового фильтрата. В опытную колбу добавляют 10 мл 1 М НСl, закрывают пробкой и помещают на кипящую водяную баню на 10 мин для гидролиза фосфорных связей. Затем раствор охлаждают и добавляют 10 мл 1 М NaOH.

В контрольную колбу (без предварительного кипячения) добавляют 10 мл 1 М НСl и 10 мл 1 М NaOH. Затем в обе колбы добавляют по 75 мл дистиллированной воды (до получения объема 100 мл).

Дальнейшие процедуры проводят обязательно одновременно. Из обеих колб отбирают по 50 мл жидкости, переносят в две мерные колбы на 100 мл и добавляют в каждую из них по 5 мл 1%-ного раствора молибдата аммония, 5 мл 1%-ного раствора аскорбиновой кислоты и дистиллированную воду до метки. Смесь в каждой колбе быстро перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре строго в течение 30 минут.

Контрольную и опытную пробы колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром (длина волны 670 нм) в кюветах с толщиной слоя 1,0 см против воды. В опытной пробе (после гидролиза) определяемый неорганический фосфат представляет собой сумму лабильно связанного фосфора и солей фосфата, присутствующих в тканях. В контрольной пробе определяются только фосфатные соли.

Из оптической плотности, найденной для опытной пробы, вычитают оптическую плотность, полученную для контрольной пробы. Концентрацию лабильно связанного неорганического фосфата в пробе находят по калибровочному графику, используя в качестве стандарта раствор KH₂PO₄. Рассчитывают количество лабильно связанного фосфора в миллиграммах на 100 г сырой массы, учитывая разведение. Производят пересчет данных на содержание АТФ и сравнивают полученное значение с известными з литературных источников.