Загальна схема і складові рідинного хроматографу
1 – насос високого тиску, 2 – вузол введення проби, 3 – блок хроматографічних колонок, 4 – блок детекторів, 5 – електронний підсилювач, 6 – прилад, що показує (реєструючий), 7 – мікропроцесор, 8 – комп'ютер
Рисунок 11. Блок-схема приладу для ВЕРХ
Блок-схема рідинного хроматографу припускає, як і в газовій хроматографії використання комп’ютерної техніки для управління і розрахунків аналітичних визначень (рис.11). Кожен блок може складатися з безлічі пристроїв, що розрізняються по складності і можливостям. Крім того речовини, що вимиваються з колонки, можуть на виході з детектора збиратися в спеціальні пристрої (збираюча система) для наступної ідентифікації.
Розглянемо послідовно структурні елементи сучасного рідинного хроматографа.
Насоси
Для виготовлення застосовують нержавіючу сталь, тефлон, кераміку, сапфір. Основними типами насосів є шприцеві й плунжерні. Переважним типом насосів є плунжерні. У таких насосах поршень робить періодичні зворотно-поступальні рухи з малою довжиною ходу. Звичайно плунжерні насоси поєднують по двох, причому поршні обох насосів працюють у протифазі. У цьому випадку пульсації швидкості подачі рухливої фази взаємно компенсуються. У мембранних плунжерних насосах безпосередній контакт рухливих деталей насоса з розчином відсутній.
Поділяючі колонки
Корпуса поділяючих колонок звичайно виготовляють із відполірованої нержавіючої сталі. Застосовують і товстостінні скляні колонки зі спеціальних сортів скла (пирекс) з внутрішнім діаметром 2—5 мм і довжиною 60— 250 мм. Підвищений тиск на вході в колонку викликає необхідність застосування укорочених колонок, так званих мікроколонок. Пробу вводять мікрошприцем через вузол введення проб.
Стандартна колонка має довжину 250 мм і внутрішній діаметр 4,6 мм і заповнена частками носія розміром 5 або 10 мкм. При цьому число теоретичних тарілок досягає 50 000 на метр, а тиск на вході колонки до 0,5 — 50 МПа. Ефективність мікроколонок При заповненні частками розміром 3 мкм досягає 100 000 теоретичних тарілок на метр.
Рухома фаза (елюєнт)
Порядок проходження розчинників через колонку відповідно до величин їх вимиваючої сили в загальному зберігається й при переході від силікагелю до іншої полярної нерухомої фази і є таким, як в тонкошаровій хроматографії.
У ВЕРХ необхідно використовувати дуже чисті розчинники. З рідин ретельно видаляють розчинені гази (які можуть утворювати пухирці й тим самим порушувати роботу детекторів) і зважені частки. Для видалення твердих часток розчини попередньо фільтрують через мікропористий фільтр. Розчинені гази видаляють, продуваючи рідину гелієм (який практично не розчиним у воді й інших розчинниках) або шляхом ультразвукової обробки.
У рідинній хроматографії розрізняють ізократичний і градієнтний режими елюювання. В ізократичному режимі через колонку безупинно пропускають рухому фазу постійного складу, наприклад, суміш 30% метилового спирту й 70% води (рис.12).
Однак більш ефективне градієнтне елюювання. У цьому випадку склад елюента у ході поділу змінюють згідно з конкретною програмою. Ефект, що досягається, аналогічний тому, що спостерігається при програмуванні температури в газовій хроматографії: час аналізу скорочується, піки компонентів розташовуються на хроматограмі більш рівномірно, мають однакову форму, а точність визначення стає рівної для всіх компонентів.
При створенні градієнта в системі високого тиску кожний розчинник подають за допомогою окремого насоса й змішують на виході з насосів. Цей спосіб дозволяє більш точно контролювати співвідношення компонентів, оскільки попереднє змішування розчинників часто сполучено зі значними змінами об'єму.
Вибір рухомої фази
Вибір може бути зроблений досить обґрунтовано, якщо відомо механізм поділу речовин, а це потребує спеціального дослідження і не завжди можливо. Тому рухомі фази дуже часто знаходять просто шляхом підбора — випадкового («метод проб і помилок») або спрямованого, з використанням методів багатофакторної оптимізації.
1 – ретинол (провітамін А)
Рисунок 12. Зворотньо-фазова ВЕРХ каротинів моркви
(колонка 62 х 2 мм, Sylasorb Si-60, 5 мкм)
При визначенні іоногених речовин здатність рухомої фази вимивати з колонки речовини змінюють, регулюючи її значення рН або вводячи в неї добавки іонних речовин (іон-парних реагентів). Обоє ці прийоми служать для того, щоб перетворити поділювані речовини в нейтральні частки, здатні утримуватися на нерухомій фазі. Так, у методі іон-парної хроматографії обумовлені іони переводять в іонні пари, додаючи в рухому фазу відповідний протиіон.
Детектори
Склад елюата безупинно контролюють детектором. Детектори в рідинних хроматографах можна об'єднати в наступні групи:
1) оптичні детектори, що складають близько 92% усіх застосовуваних детекторів (абсорбційні, флуориметричні, рефрактометричні);
2) електрохімічні детектори (потенціометричні, за електропровідністю, амперометричні);
Для виміру світлопоглинання рухомої фази на виході зі стовпчика використовують проточні фотометричні кювети Z-образної форми. Для запобігання розмивання хроматографічних піків внутрішній об'єм кювет роблять мінімальним - 1-10 мкл, а довжину оптичного шляху - від 2 до 10 мм. При вимірах в УФ-області оптичні вікна кювети виготовляють із кварцу.
Найпростішим різновидом фотометричного детектора є однохвильовий УФ-детектор. Джерелом світла служить ртутна лампа. Поблизу довжини хвилі 254 нм перебувають максимуми поглинання багатьох органічних і деяких неорганічних речовин.
Амперометричним методом можна детектувати всі речовини, здатні окислятися або відновлюватися при обраному потенціалі робочого електрода. Цим методом можна селективно й з високою чутливістю (до 10-12 г) детектувати багато біологічно активних речовин, наприклад, гормони стресу адреналін і норадреналин (катехоламин).
Відомі різні інші детектори, з яких діодно-матричні детектори (ДМД) називають детекторами УФ нового покоління. Ці детектори мають широкий хвильовий діапазон, що використовують одночасно при розширеному аналізі речовин. Сукупність сигналів від діодно-матричних детекторів піддають комп’ютерній обробці, внаслідок чого одержують багато різнопланової інформації.