Лабораторна робота №1.3

СТЕРИЛІЗАЦІЯ. МЕТОДИ СТЕРИЛІЗАЦІЇ. ПІДГОТОВКА ПОСУДУ, ІНСТРУМЕНТІВ І МАТЕРІАЛІВ ДО СТЕРИЛІЗАЦІЇ. ПОРІВНЯННЯ РІЗНИХ МЕТОДІВ СТЕРИЛІЗАЦІЇ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ.

Мета роботи - ознайомитися з принципами і методами стерилізації, освоїти правила підготовки посуду і інструментів до стерилізації.

Основні завдання роботи

1. Підготовка посуду до стерилізації.

2. Приготувати природні рослинні субстрати для стерилізації.

3. Підібрати умови стерилізація та провести аналіз мікроорганізмів-контамінатів рослинних субстратів.

Основні теоретичні відомості

Повне звільнення будь-якого матеріалу від живих мікроорганізмів і їх форм, що покояться, називається стерилізацією, або знеплідненням. У основу стерилізації покладена здатність певних чинників викликати загибель мікроорганізмів і їх спор. Агенти, що викликають загибель мікробних клітин, мають назву бактерицидними.

Стерилізація під дією високих температур. Найчастіше для стерилізації використовують високі температури, що викликають загибель клітин мікроорганізмів. Ефективність бактерицидної дії температурного чинника залежить від ступеня нагрівання, тривалості дії даної температури, виду мікроорганізму, а також від складу середовища, в якому він знаходиться. Для знищення вегетативних форм більшості мікробів достатньо температури в межах 61,5-85 °С і експозиції відповідно від 30 до 60 хв. Спори бактерій гинуть при температурі вище 100 °С. Слід пам'ятати, що при зниженні вологості стійкість бактерій і їх спор до високих температур підвищується. Так, в умовах вологого жару спори гинуть при 110-120 °С протягом 20-30 хв., а в умовах сухого жару - при 180 °С і експозиції 45 хв.

Загибель мікроорганізмів під впливом високих температур наступає в наслідок денатурації клітинних білків. Крім цього високі температури руйнують осмотичний бар'єр клітин, порушують рівновагу ферментативних реакцій.

Стерилізація під впливом високих температур - може здійснюватися різними способами: прожарюванням в полум'ї пальника, кип'ятінням, пастеризацією, сухим жаром, вологим жаром, насиченою парою під тиском (автоклавування).

Прожарюванням в полум'ї пальника стерилізують бактеріологічні петлі, бактеріологічні голки, кінчики пінцетів, пробкові свердла і деякі інші металеві предмети. Виготовляється бактеріологічна петля з платинового або ніхромового дроту довжиною 8-10 см, один кінець якого загнуть у вигляді кола, інший закріплюється в спеціальному металевому утримувачі.

Стерилізацію кип'ятінням проводять в стерилізаторі на слабкому вогні, щоб уникнути розбризкування рідини. Початком стерилізації вважається момент закипання води в стерилізаторі. Після закінчення кип'ятіння воду зливають і інструменти беруть стерильним пінцетом. Кип'ятінням стерилізують шприци (у розібраному вигляді), металеві інструменти (ножиці, скальпелі, пінцети), гумові рукавички і пробки, деякі інші предмети. Інструменти, що містять металеві частини, стерилізують в 2 %-м розчині гідрокарбонату натрію, який попереджає появи іржи.

Пастеризація (неповна стерилізація). Пастеризацією називається знищення в матеріалі тільки вегетативних кліток мікроорганізмів. З цією метою його піддають дії температури 75-80 °С протягом 5-10 хв. Пастеризують найчастіше продукти живлення (молоко, соки, ягоди, фрукти, вина і т. д.), які при дії вищих температур втрачають свої смакові і харчові якості. При пастеризації гинуть спори грибів, вегетативні клітини бактерій, у тому числі і патогенних, тоді як бактеріальні ендоспори залишаються життєздатними. їх проростанню при зберіганні продуктів перешкоджають низькі значення рН, високі концентрації цукру, відсутність кисню і деякі інші чинники.

Стерилізація сухим жаром здійснюється в сушильних шафах. Найчастіше в лабораторіях використовується електрична сушильна шафа 2В-151. Вона складається з корпусу в якому знаходиться циліндрова робоча камера. У камері розташовані знімні робочі полиці. Шафа обігрівається за допомогою нагрівального дроту, намотаного на термостійку нікелеву пластинку, що знаходиться на зовнішній поверхні камери. Простір між стінками корпусу і робочої камери заповнений термоізоляційним матеріалом. У шафу вмонтований термометр. Обігрів регулюється за допомогою автоматичного терморегулятора.

Максимальна температура в сушильній шафі досягає 200 °С. Гарячим повітрям в сушильній шафі найчастіше стерилізують скляний посуд (пробірки, лійки, піпетки, стакани, конічні колби Ерлермейєра, колби Бунзена, шприци і т. д.). Перед стерилізацією посуд ретельно миють і сушать. При стерилізації спори бактерій переносять високу температуру протягом тривалого часу.

Зазвичай тривалість стерилізації при температурі 160 °С - 2 г, при 165 - 1 г, при 180 - 40 хв., а при 200 °С – 10-15 хв. Слід мати на увазі, що при температурі 170 °С папір і вата жовтіють, а при вищих температурах обвуглюються. Після закінчення стерилізації сушильну шафу вимикають, але дверці його не відкривають до повного охолоджування, оскільки холодне повітря, що поступає всередину шафи, може викликати утворення тріщин на гарячому посуді.

Стерилізація вологим жаром (текучої парою) проводиться в апараті Коха або в автоклаві при відкритому випускному крані. Апарат Коха є металевий порожній циліндр з подвійним днищем і електронагрівальним пристроєм. Простір між верхньою і нижньою пластинками дна заповнюється на 2/3 водою. У кришці апарату вмонтований термометр і є отвір для виходу пари. У апараті Коха стерилізують головним чином живильні середовища, властивості яких змінюються при температурах вище 100 °С.

Обробку матеріалу текучою парою використовують для проведення дробної стерилізації. При цьому матеріал, найчастіше живильні середовища, піддається трьох- або чотирикратній обробці вологим жаром протягом однієї години при температурі 56-5 °С з інтервалами 24 г., протягом яких підтримується температура, сприятлива для проростання спор. Пророслі із спор вегетативні клітини швидко гинуть при черговому нагріванні матеріалу.

Стерилізація вологим жаром під тиском заснована на прогріванні якого-небудь матеріалу насиченою парою при тиску вище атмосферного. Відомо, що температура насиченої пари залежить від тиску - з підвищенням тиску його температура зростає. Оскільки з підвищенням тиску температура кипіння рідин підвищується, з'являється можливість стерилізувати їх при 100 °С і вище, не допускаючи кипіння і, отже, випаровування і розбризкування. Тривалість стерилізації парою під тиском залежить від хімічного складу матеріалу, що стерилізується, видів мікробів, що знаходяться в ньому, а також від об'єму (теплоємності) ємностей, в яких проводять стерилізацію. Умови підвищеного тиску насиченої пари створюють в спеціальних товстостінних апаратах, які герметично закриваються (автоклави). Вони бувають різній конструкції, але принципова схема їх однакова. Це дві камери - велика (робоча або стерилізаційна) і маленька (водопарова), які з'єднані між собою трубопроводом з вентилем. Водопарова камера сполучається також із зовнішнім середовищем трубкою з водомірним склом, краном і лійкою, через яку вона заповнюється дистильованою водою. Робоча камера, в яку поміщають матеріал, що стерилізується, забезпечена краном для виходу повітря, манометром для визначення тиску і запобіжним клапаном для виходу пари при надмірному підвищенні тиску.

Нагрівання води у водопаровій камері здійснюється за допомогою вмонтованих в неї електродів і регулюється автоматично. Початком стерилізації вважається той момент, коли стрілка манометра показує заданий тиск. Цей тиск підтримують шляхом регулювання підігріву. Після закінчення часу стерилізації підігрів припиняють. Необхідно дочекатися, коли тиск в автоклаві порівняється з атмосферним. Потім відкривають кран, що виводить пару. Тільки після падіння тиску до нуля і виходу пари повільно відкривають кришку автоклава. Для роботи з автоклавом допускаються особи, що пройшли спеціальне навчання.

Перевірка ефективності теплової стерилізації. Оскільки при автоклавуванні бактерицидну дію надають високі температури і насичена пара, а у більшості автоклавів (з міркувань простоти і безпеки) вмонтовані тільки манометри, кожного разу виникає необхідність переконатися в тому, що матеріал піддався дії стерилізуючої температури протягом достатнього тривалого часу. Контроль температури в автоклавах здійснюється за допомогою спеціальних термоіндикаторів - термочуттевих фарб, що змінюють забарвлення після дії стерилізуючої температури, або речовин (сірка, цукор), плавких тільки при певних температурах.

Контроль ефективності бактерицидної дії високих температур здійснюють, поміщаючи р>азом з матеріалом, підметом стерилізації, смужки папери, на які нанесені спори стійких до нагрівання бактерій, наприклад, Bacillus subtilis або ампули, шо містять спори В. stearotheimophilus, які відносяться до числа найбільш термостійких. Після закінчення стерилізації смужки паперу або ампули поміщають в умови, які сприятливі для проростання спор.

Стерилізація фільтруванням. Багато компонентів рідких живильних середовищ термолабільні і швидко руйнуються під впливом високих температур. Тому рідкі живильні середовища і інші рідкі матеріали найзручніше (значно швидше і ефективніше за дробову стерилізацію) стерилізувати фільтруванням. Вперше стерилізація рідин фільтруванням була проведена Шамберланом, учнем Л. Пастера. Він виготовив фарфоровий фільтр, що уявляє порожній циліндр, закритий з одного кінця що нагадує свічку - свічка Шамберлана. Фільтр затримує самі дрібні бактерії. Для стерилізації питної води використовують фільтр Беркефельда - свічка Беркефельда. Стінки свічок Шамберлана і Беркефельда складаються з глинозему, фарфору або кізельгуру. Ці матеріали несуть позитивний електричний заряд, тоді як бактерії заряджені негативно. Таким чином, механізм фільтрації через свічки полягає не в дії, що «просіває» їх,, а несе адсорбувальний характер. До адсорбувальних відносяться також фільтри, виготовлені з глини, азбесту і деяких інших матеріалів. Пори цих фільтрів більше, ніж розміри бактерій.

В даний час в мікробіологічній практиці широко застосовуються азбестові і скляні фільтри. Азбестові фільтри є пластинки 3-5 мм і діаметром 35 і 140 мм. Для стерилізації використовують, вітчизняні фільтри маркі «СФ» (стерилізуючий фільтр). Перед використанням азбестові пластинки вмонтовують в спеціальний фільтрувальний апарат - прилад Зейтца, складений з двох частин: металевого чи скляного полого циліндру і нижній частини з опірної сітки. На опірну сітку кладуть асбестовий фільтр і обидві частини апарату з'єднують вінтами чи зажимами. На трубку нижній частини апарату вдягається резинова пробка за допомогою якої він вставляється в колбу Бунзена. Приготовлений таким чином прилад Зейтца обгортають в папір і стерилізують в автоклаві. Рідину, що стерилізується, наливають в циліндр і з'єднують відростком колби Бунзена з вакуум-насосом. В результаті різниці тиску, що утворюється, рідина проходить через азбестовий фільтр в приймач (колбу). В апарат Зейтца можуть вмонтовуватися також стерилізуючі скляні і мембранні фільтри.

Мембранні фільтри виготовляють з ацетату целюлози або нітроцелюлози. Фільтри з нітроцелюлози є тісним переплетенням нітроцелюлозних волокон. Метод їх виготовлення дозволяє контролювати максимальний розмір частинок, що проходять через фільтр. Пори фільтрів мають неправильну форму і займають приблизно 80 % його площі. Діапазон максимальних розмірів затриманих частинок залежно від номера фільтру може варіювати від 0,01 до 8,0 мкм.

Щоб зменшити гідрофобність фільтрів, в них вводять детергент (поверхнево-активна речовина), а щоб уникнути висушування обробляють гліцерином.

Безпосередньо перед застосуванням мембранні фільтри стерилізують кип'ятінням. їх поміщають у дистильовану воду, підігрів до температури 50-60 °С і, щоб попередити скручування, кип'ятять на слабкому вогні протягом 30 хв., міняючи 2-3 рази воду. При цьому з пластинки фільтру видаляється гліцерин. Стерильні фільтри щоб уникнути їх пошкодження виймають із стерилізатора фламбірованим (стерильним) остудженим пінцетом з гладкими кінчиками. Мембранні пластинки, як і азбестові, вмонтовуються в спеціальні фільтрувальні апарати, у тому числі і апарат Зейтца.

В даний час для стерилізації застосовуються також мембранні фільтри, які відокремлюють малі макромолекули від великих і ефективно затримують вірусні частинки. Як фільтри використовуються мембрани «Діафло» або «Пеллікон», що випускаються американськими фірмами, а також вітчизняні ядерні фільтри (ядерні сита). Останні є тонкими (0,1-1 МКМ) лавсановими плівками з важкими іонами, що калібруються, отворами, розміри яких варіюють від 2 до 100 А. Плівки кріпляться на товстому (50-250 мкм) підтримуючому шарі з губчастою структурою. Діапазон молекулярних мас молекул, що пропускаються, варіює в межах від 500 до 100000 дальтон.

Стерилізація опромінюванням. На клітини бактерій летальний ефект надають ультрафіолетові, рентгенівські, гамма-, альфа-, бета- промені і нейтрони. У лабораторних умовах зазвичай використовують ультрафіолетові промені, джерелом яких є спеціальні бактерицидні лампи. Випромінювачем в них служить електрична дуга, що виникає в парах ртуті низького тиску і випускає лінійчатий спектр в ультрафіолетовій області, більше 80 % енергії якого доводиться на довжину хвилі 253,7 нм. Бактерицидні лампи використовують для часткової стерилізації відкритих поверхонь і повітря приміщень (операційні, хірургічні відділення, пологові будинки, бокси і ін.). Застосування ультрафіолету обмежене із-за малої проникаючої здатності.

Вегетативні форми бактерій чутливіші до ультрафіолетового опромінювання, чим спори, які в 3-10 разів стійкіші. Слід пам'ятати, що ультрафіолетові промені викликають гостре запалення рогівки очей. Тому необхідно стежити, щоб ні прямі, ні - відображені промені не попадали в око, і застосовувати при роботі з кварцовими лампами захисні окуляри.

Хімічна стерилізація (дезінфекція). Дезінфекція є видаленням або руйнуванням патогенних мікроорганізмів, що знаходяться на неживих об'єктах або поверхнях, за допомогою хімічних агентів, що отримали назву дезинфікуючих речовин. Дезінфекція проводиться в тих випадках, коли неможливо застосовувати стерилізацію парою або іншими фізичними методами, наприклад, коли мають справу з великими просторами, великими поверхнями і стаціонарним устаткуванням.

Бактерицидна дія Хімічних агентів обумовлюється активністю функціональних груп, концентрацією активного компоненту даної речовини, тривалістю контакту, рН, температурою, вологістю і присутністю органічної речовини. Як дезінфікуючі агенти застосовуються галогени, фенол і їх похідні, з'єднання важких металів, спирти, мікробоцидні гази і ін.

Галогени і їх похід н і. При хімічній стерилізації найчастіше застосовують хлор, йод і їх похідні. Хлор і йод активні проти всіх бактерій і їх форм, що покояться, - спор. Оскільки вони активно з'єднуються з білком, в його присутності їх слід брати в надлишку. При роботі із з'єднаннями хлору і йоду необхідно пам'ятати, що вони мають тенденцію виділятися з розчинів, додають їм неприємний запах і отруйні для тканин макроорганізму.

Для дезінфекції можуть бути використані з'єднання важких металів - ртуть, срібло, мідь. Проте оскільки препарати з ртуті (хлорид ртуті (II), оксиціанід ртуті) токсичні, а що містять срібло вартісні і надають більшою мірою бактеріостатичну, чим бактерицидну дію, їх не рекомендується використовувати для дезінфекції.

Фенолові з'єднання, наприклад о-феніл-фенол, ефективні проти вегетативних кліток бактерій у великих розведеннях і практично позбавлені запаху. Фенол надає дезінфікуючу дію на вегетативні клітини і спори бактерій, проте через неприємний запах застосовується рідко. Фенолові з'єднання не ефективні діють на бактеріальні спори.

Спирти, які феноли, містять в своїй молекулі гідроксильні групи, які додають їм; бактерицидні властивості. Для дезінфекції використовуються тільки етиловий і ізопропіловий спирти. їх дезінфікуючі властивості приблизно однакові і збільшуються прямо пропорціонально концентрації від 50 до 70°. При вищих концентраціях бактерицидна дія спиртів різко знижується. Абсолютний етиловий спирт практично позбавлений летальної дії на клітини бактерій. Спирти не викликають загибелі спор і володіють повільною знезаражувальною дією (декілька хвилин).

Стерилізуючі гази. Останніми роками встановлена здатність деяких газів вбивати вегетативні клітини і спори бактерій. До стерилізуючих газів відносяться формальдегід, окис етилену і пропіолактон. Формальдегід володіє вираженою спороцидної активністю. Максимальний стерилізуючий ефект досягається при відносній вологості 70 % і температурі 22 °С. При низьких температурах формальдегід втрачає дезінфікуючу активність. До його недоліків слід віднести гострий, дратівливий запах і здатність утворювати на поверхні органічного матеріалу, що стерилізується, шар речовини, що згорнулася, який захищає мікроорганізми, що знаходяться всередині. Окис етилену використовується для дезінфекції у вигляді газової суміші, в якій на її частку доводиться від 2 до 50 %. другим компонентом суміші є азот або вуглекислота. Окис етилену ефективно вбиває вегетативні клітини і спори бактерій, але не надає шкідливої дії на різні органічні матеріали, які легко ушкоджуються при нагріванні. її застосовують для стерилізації живильних середовищ, що містять термолабільні компоненти, пластмасових чашок Петрі і інших предметів, які плавляться при температурі вище 100°С. Оскільки окис етилену не тільки токсичний, але і достатньо леткий (температура кипіння рідини 10,7 °С), її можна легко видалити з оброблюваних об'єктів шляхом короткочасного нагрівання їх до 37 °С.

Необхідно пам'ятати, що окис етилену нестійкий і розпадається у водних розчинах, утворюючи етиленгліколь, який може викликати небажані ефекти. Крім цього окис етилену вибухонебезпечний і токсичний для людини.

1. Загальна характеристика режимів і способів стерилізації поживних середовищ.

Найбільше наочно існуючі способи й режими стерилізації можна проілюструвати прикладами, запозиченими із практики роботи різних мікробіологічних виробництв, про що свідчать дані табл. 1.

Таблиця 1.

Приклади режимів термічної стерилізації різних рідин у технології

мікробіологічних виробництв

Середовищe	Спосіб і режим стерилізації
Живильне, на основі бульйону з казеїнового гідролізату; те ж, але з добавкою 40% дріжджового автолізату	Первинний: 120 °С, 15 хв.; 115 °С, 30 хв.; 110°С, 60 хв. Всі режими забезпечують стерильність середовищ, не впливають на вміст амінного азоту в них, а також на кінцевий урожай вирощуваних бактерій Флекснера
Фізіологічний розчин	Періодичний 120 °С, 60 хв.
Суміш глюкози, фосфату пептону	Періодичний 122 °С, 15 хв.; рН 7,2 Стерильна рідина набуває інгібуючих властивостей
Те ж саме	Те ж, але рН 5,4 1 Стерильна рідина не набуває інгібуючих властивостей
Піногасник (тип і склад не зазначений)	Періодичний: 120-126 °С, 4 год; 126-130 °С, 2 год
Живильне (соєве борошно, хлорид натрію, глюкоза, агар-агар, вода)	Періодичний: 115° С, 30 хв.; рН 6,9-7,1
Живильне № 6 ВНПА (кукурудзяний екстракт, сульфат амонію, хлорид натрію, крейда, агар-агар, водопровідна вода)	Періодичний: 115° С, 30 хв.; рН 7,0-7,2
Живильне, при виробництві антибіотиків (склад не зазначений)	Періодичний: 120-124 °С, 1 год
Живильне, містить меласу і використовується в ацетонобутиловому виробництві	Періодичний: 120 °С, 13 хв.; 115 °С, 15 хв.
Живильне, містить глюкозу й солі	Безперервний: 145 °С, 0,5-2 хв. |
Живильне, для одержання рибофлавіну	Безперервний: 133 °С, 4 хв; рН 4,5 |
Живильне, для одержання вітаміну В12	Безперервний: 161 °С, 13 хв..; рН 4,5
Живильне, для одержання бутанолу, ацетону, етанолу	Безперервний: 133 °С, 3 хв.; рН 6,5
Живильне, для одержання глюконату натрію	1 Безперервний: 133 °С, 5хв.; рН 4,5
Живильне, для одержання ітаконової кислоти	1 Безперервний: 147 °С. 5 хв.; рН 6,1
Живильне, для одержання грибної амілази	Безперервний: 161 °С, 13 хв.; рН 5,0

Дослідженнях на лабораторному рівні, які пов'язані з кількісною оцінкою процесів ферментації (наприклад, при відпрацьовуванні лабораторних регламентів), забезпечення постійного складу стерильних живильних середовищ (та інших рідин) є однією з необхідних умов одержання об'єктивних даних про процеси. На цьому етапі визначаються основні характеристики, що вказують на біологічну й технологічну повноцінність рідин. Наприклад, для живильних середовищ необхідно визначати рН до й після стерилізації, вміст загального й амінного азоту, цукрів, термолабільних компонентів (вітаміни, деякі амінокислоти) й ін. При цьому бажано визначати константи швидкості зниження кожного компонента залежно від температури і рН, а також зміни загального числа компонентів залежно від режимів стерилізації (сполучення температури й тривалості її впливу). Таким чином, уже на лабораторному рівні можуть вирішуватися важливі технологічні питання.

Перехід до напівпромислового й промислового виробництва повинен здійснюватися тільки на основі кількісних характеристик процесу стерилізації отриманих у лабораторіях. Однак при цьому потрібно враховувати й такі фактори, як зміна масштабів, у яких Здійснюється процес. Наприклад, перехід від колби з 10 мл живильного середовища до ферментеру, що містить 10 м³ такого ж середовища, пов'язаний зі зміною масштабу в 106 разів. При вихідній засіяності живильного середовища 10⁶ спор на 1 мл у першому випадку буде потрібно інактивація 5·10⁷, а в другому - 5·10¹³ спор. При цьому в обох випадках бажано не тільки досягнення необхідної ефективності стерилізації, але й збереження на однаковому рівні якості живильного середовища, в тому числі її ростових властивостей. У повному обсязі таке завдання можна вирішити тільки стосовно до рідин, що мають стандартний склад до стерилізації. До їхнього числа належать деякі так звані синтетичні живильні середовища, фізіологічний розчин, а також водяні розчини цукрів і амінокислот. Як приклад у табл. 2 наведений склад синтетичного живильного середовища.

Таблиця 2.

Склад синтетичного (сольового) живильного середовища

Компонент	Вміст, мг
Джерело вуглецю	2,0
Буфер (0,1 М)	12,1
NaCl	5,4
KC1	3,0
NH4Cl	1,1
CaCl2	0,011
MgCl2	0,095
KH2PO4	0,087
Na2SО4	0,023
FeCl3	0,00016
Дистильована вода	1000

Очевидно, що при переході до стерилізації рідин нестандартного складу (живильних середовищ на основі природної сировини) може вирішуватися, як правило, лише завдання стандартності впливу технологічних факторів (температура, рН, тривалість) незалежно від масштабу (пробірка, колба ферментатор) або способу (циклічний, безперервний) стерилізації. У ньому випадку повинна забезпечуватись тільки умовна, стандартність живильних середовищ тобто по обґрунтованому на даний період набору тестів, у тому числі й кінетичних параметрів росту цільових мікроорганізмів.

Важливо відзначити, що стосовно до діючого мікробіологічного підприємства рішення про вибір тих або інших методів і режимів стерилізації, раніше обґрунтованих експериментально, повинне прийматися з обліком конкретних технічних особливостей даного виробництва (наявність устаткування, параметри нагрітої пари та ін.), а також економічних факторів. При цьому необхідно знати характеристики рідин, що стерилізуються (фізико-хімічні показники, засіяність сторонньою мікрофлорою, наявність ростових факторів); режими, відпрацьовані в лабораторії, і гарантовану при цьому ефективність інактивації контамінантів; особливості, що впливають на переніс зазначених режимів в умови промислового виробництва (характеристики апаратів, відмінність у масштабах, зміни в засіяності рідин, необхідна ефективність стерилізації, час, що відведений на стадію стерилізації в загальному технологічному процесі та ін.).