Хідреакції

Зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20—35 циклів, кожен з якихскладається з трьохстадій

1 етап:

Обпалюванно – термічне розділення 2- ниткової молекули ДНК на 2 ланцюги.

2 Етап:

В середовище вносять праймери комплементарні нуклеотидним послідовностям обох ланцюгів. Потім в середовище вносять tag – полімер азу, яка запускає отримання вторинних копій ланцюгів ДНК. Цей процес повторюють багато разів, що дозволяє отримувати досліджувальні фрагменти ДНК в велицій кількості.

3 етап: Ідентифікацію копій ДНК проводять методом електофореза.

7. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

Компоненты. Для постанов­ки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад­сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микро­организмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обладающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гор­мона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительнос­ти к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфич­ностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токси­нов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные анти­тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи­ческих антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на­груженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой специфичности.

Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри­цательной реакции появляется осадок в виде компактного диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — харак­терный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями.

8.В мікробіологічнійпрактицівикористовуютьпрепарати “роздавленакрапля”, “вися­чакрапля”, препарат “відбиток” та препаратифіксованихзабарвленихклітин. Препарат “роздавленакрапля”. На предметнесклонаносять петлею краплюстери­льноїводопровідної води, суспендують у ніймінімальнукількістьмікробнихклітин, а по­тім “роздавлюють” покривнимсклом. Краплясуспензіїклітин повинна бути такою, щобпісляїїроздавлюваннярідина не виступала за межіскла. Препарат “висячакрапля”.Краплюсуспензіїмікроорганізмів петлею на­носять на покривнескло, зверхупритискаютьспеціальнепредметнескло з лункою у цен­трі і перевертають. Крапля повинна вільновисіти над лункою, не торкаючисьїїкраїв. Краї лунки попередньозмазуютьвазеліном – краплягерметизована у вологійкамері, щодозво­ляєтривалеспостереження за об’єктом. Виготовлення фіксованих забарвлених препаратів клітин включає ряд послідовних етапів:

1. ^ Виготовлення мазка. На знежирене предметнее скло бактеріальною петлею наносять краплю стерильної води і суспендують у ній невелику кількість клітин мікроорганіз­мів. Отриману суспензію рівномірно розтирають петлею на площі 1-2 см². Мазок по­винен бути тоненьким, рівномірним за товщиною, овальним за формою.

2. Висушування мазка. Краще всього висушувати мазок при кімнатній температурі на повітрі.

3. Фіксація мазка передбачаєдекількамоментів:

• убити (знешкодити) клітинимікроорганізмів;

• забезпечити краще прилипання клітин до скла;

• зробити мазок більшсприйнятливими до барвників.

Найбільшрозповсюдженим методом фіксації є термічнаобробка. Зцією метою препа­рат тричіпроводять через полум’я пальника, тримаючискло мазком вгору. Мазок не треба перегрівати, так як при цьомувідбуваютьсягрубізміниклітинних структур, а інколиїхморфології. Для вивченнятонкоїбудовиклітинивикористовуютьфіксаціюхімічнимирі­динами.

4. Фарбування. Розрізняютьпрості й диференційніметодизабарвленнямікробнихклі­тин. При простомуфарбуваннізабарвлюється вся клітина, добре видно її форма й роз­міри. Методи диференційного фарбування передбачають виявлення деяких клітинних структур (запасні речовини, включення, спори…). Для простого фарбування викорис­товують якийсь один барвник (генціановий фіолетовий,метиленовий синій, фуксин). Для цього фіксований препарат кладуть на паралельні скляні рейки (місток) над крис­талізатором (кюветою) і заливають препарат фарбою на 1-3 хв. (рис. 11). Після закін­чення фарбування препарат промивають водою до тих пір, поки вода не стане безко­льоровою. Потім препарат висушують на повітрі, наносять на мазок краплю імерсії і мікроскопіюють. Після розгляду препаратів фронтальну лінзу об’єктива необхідно протерти.

9.Реакция агглютинации основана на специфическом взаимодействии антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками. В результате такого взаимодействия образуются частицы-агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат). В реакции агглютинации могут участвовать бактерии, простейшие, грибы, дрожжи, риккетсии, эритроциты и другие клетки, как живые, так и убитые. Протекает реакция в две фазы: первая — специфическое соединение антигена и антитела, вторая — кеспецифическая, т. е. образование видимого агглютината. Выпадение агглютината происходит в присутствии электролитов, например хлорида натрия. Находящиеся в агглютинате микроорганизмы остаются живыми, но теряют подвижность.

Реакцию агглютинации широко применяют для серо-логической диагностики инфекционных заболеваний и определения антигенной структуры выделенных микробов. Для установления антигенной структуры возбудителя, выделенного из организма больного или носителя, используют специфическую иммунную сыворотку, полученную иммунизацией животных (кролика, осла, барана) определенными микроорганизмами. Идентификацию микроба проводят в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными или монорецепторными сыворотками или в пробирках с видовыми агглютинирующими сыворотками. Адсорбированные сыворотки содержат антитела только к специфическим для данного микроба антигенам, а монорецепторные — только к одному специфическому антигену возбудителя. Видовые сыворотки содержат антитела ко всем антигенам определенного микроба.

При.определении наличия антител в сыворотке крови больного ее разводят изотоническим раствором хлорида натрия начиная с разведения 1 : 50 до 1 : 800 или более. В каждое разведение добавляют взвесь живых или убитых микробов. Препараты, содержащие микробы, убитые нагреванием или формалином, называют диагностикумами. Диагностикумы, полученные путем прогревания культур микроорганизмов, содержат только соматические антигены. При использовании только формалина у микробов сохраняются и жгутиковые антигены.

При наличии антител в крови больного происходит склеивание взятого в реакцию диагностикума и образование осадка (агглютината) на две пробирки. В этом случае результаты реакции агглютинации расценивают как положительные. В контрольной пробирке, куда вносят изотонический раствор хлорида натрия и диагностикум, взвесь микробов должна быть гомогенной (отрицательная реакция агглютинации).

Учет результатов реакции агглютинации при некоторых заболеваниях, например лептоспирозе, проводят только микроскопически в темном поле зрения микроскопа (микроагглютинация). Для постановки серологического диагноза заболевания учитывают диагностический заболевание. Обычно он соответствует разведению сыворотки 1 : 100 или 1 : 200.

Антитела в сыворотке крови больного с помощью реакции агглютинации можно выявить при заболевании брюшным тифом и паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакция Райта), туляремии и др.