Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Новосибирский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

(ГБОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития России)

ПЕДИАТРИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра медицинской химии

ПРАКТИКУМ

К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ

ПО БИОХИМИИ

Под редакцией профессора В.И. Шарапова

Учебное пособие

для студентов 2-го курса лечебного, педиатрического, стоматологического и медико-профилактического факультетов

Новосибирск - 2012

Под редакцией профессора В.И.Шарапова

Практикум к лабораторным занятиям по биохимии. – Изд. испр. доп.- Новосибирск, НГМУ.- 2012.- 40с.

В настоящих методических указаниях представлены лабораторные работы, выполняемые на практических занятиях по дисциплине «биологическая химия».

Лабораторные работы приведены в соответствии с рабочими программами по биологической химии для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов. Учебное пособие может быть использовано студентами для подготовки к практическим занятиям, коллоквиумам и экзамену по биологической химии.

Рецензенты:

О.Р. Грек, д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии НГМУ,

А.А. Зубахин, д.м.н., профессор кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии НГМУ

Переработанное пособие утверждено на заседании кафедры медицинской химии

(протокол № 8 от 14.11.2011г.)

Утверждено и рекомендовано к печати ЦМК по физиологии

(протокол № 2 от 18 января 2012г.)

© Шарапов В.И.

© Новосибирский государственный

медицинский университет, 2012 г.

ПРАВИЛА РАБОТЫ НА КФК-2

стр

Лабораторная работа №1

Определение общего белка сыворотки крови по биуретовой реакции......................................................................1

Лабораторная работа №2

Определение активности псевдохолинэстеразы сыворотки крови...........................................................................2

Лабораторная работа №3

Определение трансаминазной активности сыворотки крови....................................................................................3

Лабораторная работа №4

Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови..........................................................................4

Лабораторная работа №5

Определение активности амилазы (диастазы) в моче амилокластическим способом............................................5

Лабораторная работа №6

Количественное определение глюкозы в сыворотке крови глюкозооксидазным методом

( по окислению фенофталеина)............................................................................................................................................6

Лабораторная работа №7

Определение глюкозы о- толуидиновым методом..........................................................................................................6

Лабораторная работа №8

Качественная реакция на определения сахара в моче- реактив Ниландера...........................................................7

Лабораторная работа №9

Турбидиметрический метод определения бета-липопротеидов сыворотки крови

по Бурштеиу и Самаи.......................................................................................................................................................7

Лабораторная работа № 10

Реакция образования иодоформа ( на ацетоновые тела)...............................................................................................8

Лабораторная работа №11

Определение содержания холестерина в сыворотке крови (метод Ильке)..............................................................8

Лабораторная работа №12

Количественное определение общей кислотности. Пирамидоновая проба на обнаружение крови в

желудочном соке. Реакция Уффельмана на молочную кислоту..................................................................................9

Лабораторная работа №13

Определение активности ГГТП сыворотки крови.......................................................................................................10

Лабораторная работа №14

Количественное определение мочевины в сыворотке крови.....................................................................................10

Лабораторная работа №15

Количественное определение витамина С в сыворотке крови....................................................................................11

Лабораторная работа №16

Определение содержания витамина С в моче..................................................................................................................11

Лабораторная работа №17

Коагуляционная проба Вельтмана......................................................................................................................................12

Лабораторная работа №18

Определение общего гемоглобина методом щелочной денатурации...........................................................................12

Лабораторная работа №19

Определение билирубина методом Иедрашека................................................................................................................13

Лабораторная работа №20

Определение кальция, фосфора в сыворотке крови титрометрическим методом

с применением мурексида.....................................................................................................................................................14

Лабораторная работа №21

Качественные реакции на неорганические и органические составные части мочи...............................................14

Лабораторная работа №22

Определение белка слюны биуретовым методом...........................................................................................................15

Лабораторная работа № 1

Количественное определение активности амилазы слюны..........................................................................................16

Лабораторная работа №2

Определение активности щелочной фосфатазы слюны.................................................................................................16

Лабораторная работа №3

Определение трансаминазной активности слюны.........................................................................................................17

Лабораторная работа №4

Определение кальция в слюне титрометрическим методом с применением мурексида......................................18

Правила работы на кфк-2

1.Калориметр включить в сеть за 15 мин. до начала измерений. Во время прогрева кюветное отделение должно быть открыто (при этом шторка перед фотоприемниками перекрывает световой пучек).

2. Установить необходимый светофильтр. При переключении светофильтров ручка «чувствительность» должна находится в положении «1» (красный светофильтр 670- «1», зеленый светофильтр 540- «1»), а ручка «установка 100 Грубо» в крайнем левом положении (это предохраняет прибор от перегрузки и порчи).

3. В световой поток поместить кювету с контрольным раствором по отношению к которому производят измерения.

4. Во вторую ячейку кюветодержателя поместить кювету с исследуемым раствором.

5. Закрыть крышку кюветного отделения.

6. Ручка ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ и УСТАНОВКА 100 вначале ГРУБО, затем ТОЧНО установить отсчет 100 по шкале калориметра.

7. Поворотом ручки под кюветным отделением до упора, ввести в световой поток кювету с исследуемым раствором.

8. Снять отсчет по шкале Д в единицах оптической плотности.

Лабораторная работа № 1

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА СЫВОРОТКИ КРОВИ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Значение метода:

1) Нормопротеинемия 60-80г/л.

2) Гипопротеинемия:

1. Относительная (гидремия при нагрузке водой, водных отравлениях).

2. Абсолютная вследствие:

а) подавления синтеза белка (альбуминов при нарушении функции гепатоцитов, глобулинов при всех формах недостаточности РЭС).

б) потери белков преимущественно альбуминов (нарушение функции желудочно-кишечного тракта, нарушение почечного фильтра, кровоизлияния, увеличение проницаемости капилляров - отеки, обширные экссудаты, обширные выпоты в серозные полости);

в) усиление расхода альбуминов при голодании.

3) Гиперпротеинемия:

1. Относительная (обезвоживание)

2. Абсолютная вследствии усиления синтеза глобулинов (злокачественные новообразования, ряд форм лейкозов, инфекционное или токсическое раздражение РЭС).

Принцип метода: Биуретовый метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного комплексного соединения меди с пептидными группами белка. Характерная фиолетовая окраска раствора пропорциональна числу пептидных групп.

Ход определения: К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 5 мл биуретового реактива (состав : СuSO4, 5H2O, NaOH, сегнетова соль). Смешивают, избегая образования пены. В контрольную

пробу к 0,1мл физ.раствора добавляют 5мл биуретового реактива. Через 30 мин измеряют оптическую плотность опытной и контрольной проб на фотоэлектроколориметре. Зеленый светофильтр в кювете толщиной 1см против контроля. Окраска стабильная в течении 1 часа.

Расчет: Концентрацию белка в сыворотке крови определяют по калибровочному графику.

Норма 63-83 г/л.

Лабораторная работа № 2 определение трансаминазной активности сыворотки крови.

Значение метода: Аминотрансферазы (АЛТ и АСТ) представляют собой ферменты, участвующие в переносе аминогрупп от альфа-аминокислот к альфа- кетокислотам. Коферментом в этой реакции является производная Вит В6- пиридоксальфосфат. Аминотрансферазы относятся к широко распространенным ферментам в организме, к ряду внутриклеточных. В сыворотке крови активность этих ферментов в норме не высока. Органические поражения при острых и хронических заболеваниях, сопровождаются деструкцией клеток, приводят к выходу трансаминаз из очага поражения в кровь.

АЛТ-содержится в высоких концентрациях в печени и в меньших количествах в скелетных мышцах, почках, сердечной мышце. Значительное повышение (в 10-100 раз) активности АЛТ в крови наблюдается при вирусном гепатите, токсическом некрозе печени. Особое значение имеет определение АЛТ в инкубационный период вирусного гепатита, а также для постановки диагноза при безжелтушной форме этого заболевания и эффективности лечения.

АСТ- широко распространена с высокими концентрациями в сердце, печени, скелетных мышцах, почках, эритроцитах. Повреждение любой из этих тканей может привести к повышению концентрации АСТ в сыворотке крови. Особое значение определения АСТ имеет для диагностики инфаркта миокарда и динамики заболевания. Уже через три часа после заболевания АСТ повышается, в сыворотке на 4-5 сутки наблюдается пик подъема, к 7 суткам активность АСТ должна вернуться к норме.

Активность АСТ определяется также в ротовой жидкости. Источником АСТ являются эпителиальные клетки, фибробласты, лейкоциты крови и плазма крови. В норме активность АСТ в ротовой жидкости следовая. Увеличение активности АСТ говорит о повреждении тканей парадонта и может служить одним из признаков гингивита.

Принцип метода: О трансаминазной активности сыворотки крови судят по количеству ПВК, образующейся при переаминировании из аланина или в результате декарбоксилирования щавелеуксусной кислоты, образующейся при переаминировании из аспарагиновой кислоты (АСТ). ПВК взаимодействует с 2,4-динитрофенилгидразином, с образованием 2,4-динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты. При обработке динитрофенилгидразона щелочью образуется окрашенное в красный цвет соединение. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству ПВК.

Ход работы: В пробирку вносят 0,1мл сыворотки и 0,5мл субстратной смеси, составленной из аланина и альфа-кетоглутаровой кислоты. Пробирку помещают в термостат при 37 град С на 15 минут, затем добавляют 0,5мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и оставляют стоять при комнатной температуре на 10 минут, после чего приливают 5мл NаОН и через 10-15 минут колориметрируют на ФЭКе в кювете на 0,5см с зеленым светофильтром против контроля.

Контроль: К 0,2мл Н2О приливают 1мл субстратной смеси, 1мл 2,4- динитрофенилгидразина и через 15 минут 10мл NаОН (обязательно соблюдать порядок добавления реактивов). После фотометрирования используют калибровочный график. Активность АЛТ выражают в МКМ ПВК, образованной под действием ферментов, содержащихся в 1мл слюны за час при 37 град

Норма: АЛТ- 0,1-0,68 мкм/л.ч

АСТ- 0,1-0,45 мкм/л.ч

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПСЕВДОХОЛИНЭСТЕРАЗЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ.

Значение метода: определение сывороточной псевдохолинэстеразы имеет важное значение, как метод функционального исследования печени. Этот фермент синтезируется в клетках печени и относится к группе секреторных ферментов. При нарушении белоксинтезирующей активности печени, содержание фермента в сыворотке крови сокращается.

Принцин метода: метод основан на фотометрическом определении концентрации уксусной кислоты, образованной при гидролизе ацетилхолинхлорида ацетилхолинэстеразой сыворотки крови.

Ход работы:

1 этап. В 2 пробирки (опыт и контроль) разливают 2,5 мл вероналового буфера с индикатором феноловым красным (рН 8,4) приливают 0,05 мл сыворотки крови и прогревают 5 минут в термостате при 37 градусах Цельсия.

2 этап. В обе пробирки приливают 0,1 мл (2-3 капли) ацетилхолинхлорида.

В контрольную пробу добавляют 2-3 капли прозерина (ингибитор фермента) и инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут.

3 этап. После инкубации сразу же в опытную пробу добавляют 0,1мл (2-3 капли) прозерина, ингибитора фермента. Смесь охлаждают при комнатной температуре.

4 этап. Производят измерение оптической плотности опытной пробы против контроля на ФЭКе в кювете на 0,5 см при зеленом светофильтре. Окраска устойчива в течение часа.

Расчет: из показателя оптической плотности холостой пробы вычитают показатель оптической плотности опыта и по калибровочному графику находят активность фермента, которая выражается в микромолях уксусной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки крови в течении часа при 38 градусах Цельсия.

Норма: 160-340 мкМ./ час.