2.6.2 Посев

Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом (рисунок 1) разлили расплавленную агаризованную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри от 15 до 20 см³ в каждую. Чашки оставили на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. Поверхности агаризованных сред перед посевом подсушили для удаления конденсационной воды, поместив чашки в термостат на 2-3 суток крышками вниз.

Рисунок 1 – Схема приготовления разведений и посева суспензии микроорганизмов

В чашку Петри с подсушенной средой внесли точно измеренный объем (0,1 см³) соответствующего разведения и распределили его стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводили из трех последних разведений, причем из каждого делали по два параллельных высева. Для каждого разведения использовали стерильный шпатель. После посева чашки Петри поместили в термостат крышками вниз.

2.6.3 Подсчет выросших колоний

Колонии микроорганизмов подсчитывали через 2-3 суток инкубации. Подсчет проводили, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отмечали точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делили на секторы, просчитывали колонии в каждом секторе и суммировали результаты.

Лучшим разведением считали то, из которого при высеве в чашке Петри вырастает от 30 до 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не использовали. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммировали и определяли среднее число колоний, выросших при высеве из разведения на одной чашке.

Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляли по формуле:

где М – количество клеток в 1 см³;

а – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;

V – объем суспензии, взятый для посева, см³;

10 – коэффициент разведения;

n – порядковый номер разведения, из которого сделан высев.

2.7 Химический анализ методом газовой хроматографии

В качестве метода определения индивидуального и группового углеводородного состава использовалась газовая хроматография.

Содержание углеводородов в нефтепродукте определяли на хроматографе «Хроматэк-Кристалл 5000» с пламенно-ионизационным детектором при следующих условиях:

- длина колонки – 100 м;

- диаметр колонки – 0,25 мм;

- температура испарителя – 295⁰С;

- температура термостата – 290⁰С;

- газ-носитель – гелий;

- расход газа-носителя – 315 мл/мин;

- общее время анализа – 2ч 30мин.

Для анализа использовали ГОСТ Р 52714-2007 «Бензины автомобильные. Определение индивидуального и группового углеводородного состава методом капиллярной газовой хроматографии».

Представленный образец нефтепродукта вводили в газовый хроматограф, оснащенный капиллярной колонкой, содержащей в качестве твердой фазы метилсилоксан, нанесенный на стенки кварцевой капиллярной колонки.

Под действием газа-носителя – гелия образец проходил через колонку, в которой его компоненты разделялись. Компоненты регистрировались пламенно-ионизационным детектором при их элюировании из колонки. Сигнал детектора обрабатывался системой электронного накопления данных и интегрирующим компьютером. Каждый получаемый пик идентифицировался путем сравнения его индекса удерживания по таблице.

Аппаратура

1. Хроматограф. При выполнении измерений применяли газовый хроматограф «Хроматэк-Кристалл 5000» с пламенно-ионизационным детектором, блоком программирования температуры термостата колонок, а также электронные средства поддержания скорости и давления потока газа-носителя, водорода и воздуха, обеспечивающие стабильность получения характеристик удерживания анализируемых компонентов.

2. Колонка. В настоящем методе использовали кварцевую капиллярную колонку длиной 100 м, внутренним диаметром 0,25 мм, покрытую пленкой привитого на ее поверхности диметилсилоксана толщиной 0,5 мкм.

3. Программное обеспечение для обработки хроматографических данных

использовали систему полностью автоматизированной обработки хроматограмм «Хроматэк ДНА».

4. Микрошприц для ввода пробы вместимостью 1 мм³ (1мкл).

Вывели хроматограф на режим, указанный в таблице 2

Таблица 2 - Режим работы хроматографа

Показатель		Значения
Инжектор
Температура, °С Деление потока Лайнер (вкладыш) Объем пробы, мкл	295 200:1 Стекловолокно 0,2
Детектор
Температура, °С Скорость потока газов см3/мин: водород воздух	290 20 200
Колонка
Длина, м Внутренний диаметр, мм Толщина пленки, мкм Жидкая фаза Общее время анализа, мин	100 0,25 0,5 100%-ный диметилсилоксан 150

Обработка результатов

Идентификацию хроматографических пиков проводят по линейным или логарифмическим индексам удерживания углеводородов.

Рассчитывают индекс удерживания углеводородов I_x по формуле

,

где t_x – время удерживания определяемого углеводорода, мин;

t_z – время удерживания нормального парафина с числом углеродных атомов Z в молекуле, элюирующегося до идентифицируемого углеводорода;

t_z+1 – время удерживания нормальных парафиновых углеводородов с числом углеродных атомов в молекуле Z+1, элюирующихся после идентифицируемого углеводорода;

Z – число атомов углерода в молекуле.

По формуле (1) происходит автоматический расчет индексов удерживания, по которым осуществляется идентификация компонентов бензина путем сравнения их с индексами удерживания, приведенными в базе данных программного обеспечения.