Глава 2 Экспериментальная часть

2.1 Объект исследования

В качестве объекта исследования биодеструкции нефтепродуктов углеводородокисляющими микроорганизмами был выбран Нефрас С2-80/120 ⁰С; ТУ 38-401-67-108-92 (ЗАО «Рязанская нефтеперерабатывающая компания»).

Нефрас – это прозрачная маслянистая жидкость являющаяся продуктом перегонки нефти и предназначенная для промывки деталей и снятия консервирующих покрытий, применяемая в качестве растворителя в лакокрасочной промышленности. Нефрас является многокомпонентной системой, включающей в себя 98 индивидуальных компонентов всех классов углеводородов и содержащей минимальный процент ароматических углеводородов (0,665 % масс.) вследствие деароматизации.

2.2 Биопрепарат

В работе использовался биопрепарат «МД», произведенный ООО «Экойл» (г. Томск). Биопрепарат является комплексным, т.е. содержит несколько штаммов микроорганизмов-деструкторов, способных утилизировать углеводороды с различной длиной углеродной цепи. Комплексный биопрепарат «МД» основан на способности микроорганизмов-деструкторов использовать в качестве источников питания нефть и нефтепродукты. Биопрепарат «МД» выпускается в 2-х формах: сухая и жидкая.

Биопрепарат «МД» (сухой) – концентрат клеток микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов с плотностью микроорганизмов не менее 10⁸ КОЕ, нанесен на органоминеральный носитель, в состав которого входят микроэлементы и стимуляторы роста микроорганизмов, высушен щадящими методами, что позволяет сохранить жизнеспособность клеток.

Характеристики биопрепарата «МД» (сухой):

1. Диапазон рН 5,0-8,5

2. Нормы внесения биопрепарата 15-20 кг/Га

3. Срок хранения 2 года

Биопрепарат «МД» (жидкий) – жидкая форма биопрепарата «МД» (сухой), маточная культура с плотностью микроорганизмов не менее 10⁸ КОЕ.

Характеристики биопрепарата «МД» (жидкий):

1. Диапазон рабочего рН 5,0-8,5

2. Нормы внесения биопрепарата 25-30 л/Га

3. Срок хранения – 6 месяцев при температуре от 0 до +5 °С

В эксперименте по биодеструкции нефраса использовалась жидкая форма биопрепарата «МД». Диапазон рабочих температур биопрепарата «МД» - от +5 до +37⁰С, обязательно необходимым условием является влажная среда.

2.3 Исследование биодеструкции нефраса углеводородокисляющими микроорганизмами биопрепарата «мд»

В колбу объемом 2 дм³ поместили 1 дм³ раствора макросолей и 1 см³ раствора микросолей. Затем добавили нефтепродукт (нефрас) в количестве 5% от общего объема (50 см³) и посеяли микроорганизмы биопрепарата «МД» (жидкий) на данную среду в количестве 5% от общего объема (57,5 см³).

Колбу закрыли ватно-марлевой пробкой и закрепили на термостатируемом перемешивающем устройстве ЛАБ-ПУ-01. Культивирование углеводородокисляющих микроорганизмов протекало в течение 48 суток при температуре 32°С и перемешивании со скоростью 105 об/мин.

2.4 Приготовление минеральной и питательной сред

Состав минеральной среды:

Макросоли	Микросоли
NH4H2PO4 10 г	Трилон Б 500 мг
K2HPO4 10 г	FeSO4·7H2O 200 мг
MgSO4 0,7 г	ZnSO4·7H2O 10 мг
FeSO4·7H2O 0,0125 г	MnCl2·4H2O 3 мг
ZnSO4·7H2O 0,0125 г	CoCl2·6H2O 20 мг
MnSO4·5H2O 0,0125 г	H3BO3 30 мг
CuSO4·5H2O 0,003 г	CuCl2·6H2O 2 мг
NaCl 0,1 г	Na2MoO4·2H2O 3 мг

Растворы макро- и микросолей готовили в 1 дм³ и 100 см³ воды соответственно. Растворы фосфатов входящих в состав макросолей готовили отдельно, т.к. в процессе стерилизации в автоклаве они выпадают в осадок и в дальнейшем вновь требуют растворения.

Приготовление питательных сред. Приготовление мясо-пептонного бульона (МПБ). Первый этап - получение мясной воды. Мясо, очищенное от жира и от сухожилий, пропускали через мясорубку, заливали двойным количеством холодной водопроводной воды и настаивали в течение суток в прохладном месте. Затем мясной настой вместе с мясом кипятили в течение 1 часа, после чего остужали, фильтровали, доливали водопроводной водой до первоначального объема, разливали по бутылям и стерилизовали при давлении 1атм. 30 минут. Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины. Второй этап - к мясной воде прибавляли 1% сухого пептона и 0,5% хлори­да натрия, кипятили, устанавливали pH 20 % раствором едкого натра.

Приготовление мясо-пептонного агара (МПА). К мясо-пептонному бульону добавляли 2% морской водоросли агар-агара, который плавится при 100°С и затвердевает при комнатной температуре. После стерилизации в автоклаве мясо-пептонный агар, разлитый в чашки Петри, оставляли застывать.