2.8 Анализ метаболитов методом хромато-масс-спектрометрии

По истечении эксперимента был проделан анализ метаболитов на содержание карбоновых кислот методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии на приборе Agilent 7890A при следующих условиях:

- колонка HP-5MS;

- длина колонки – 30 м;

- температура колонки – 290°С;

- температура испарителя – 250°С;

- метод ионизации – электронный удар;

- энергия ионизации – 90 эВ;

- газ-носитель – гелий;

- расход газа-носителя – 1мл/мин;

- режим деления потоков – 30:1;

- объем вводимой пробы – 1см³.

До анализа была проделана сложная процедура пробоподготовки, включающая в себя процесс дериватизации карбоновых кислот.

Из колбы содержащей остаточные углеводороды, продукты метаболизма и биомассу была взята проба объемом 300 см³. Пробу высушивали до сухого остатка на ротационном испарителе Rotavapor R-215. Сухой остаток растворяли в гексане при кипячении с обратным холодильником в течение 2 часов, затем отгоняли растворитель таким же образом, что и воду. В колбу к сухому остатку добавляли 10 см³ метанола, 2 см³ серной кислоты и 5 см³ эфирата трифторида бора. Эту смесь нагревали в течение 2 часов при температуре 30-40°С. Далее надосадочную жидкость вводили в ГХ/МС систему.

2.9 Оценка эффективности деструкции нефти углеводородокисляющими микроорганизмами

Во время работ по рекультивации загрязненных нефтью и нефтепродуктами земель и водных водоемов на месторождениях г. Стрежевой (Томская область) из нефтезагрязненных болот были отобраны пробы грунта для выделения новых штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов. Пробы были посеяны на минеральную среду с добавлением нефти в качестве единственного источника углерода и получены накопительные культуры. Накопительные культуры были посеяны методом предельных разведений на плотные среды и единичные колонии были выделены в чистую культуру.

Чистые культуры были посеяны на жидкую минеральную среду с добавлением нефти в качестве единственного источника углерода.

Для эксперимента по оценке эффективности деструкции была приготовлена минеральная среда Адкинса следующего состава: KH₂PO₄ 0,75 г, K₂HPO₄ 1,50 г, NH₄Cl 1,00 г, MgSO₄·7H₂O 0,20 г, KCl 0,10 г.

В 10 колб на 250 см³ вносили по 150 см³ питательной минеральной среды и 5 см³ нефти Западно-Катыльгинского месторождения (г. Стрежевой, Томская область). Был произведен соскоб с чашек Петри и внесение культур углеводородокисляющих микроорганизмов в колбы. Культивирование продолжалось в течение 14 дней на термостатируемом перемешивающем устройстве ЛАБ-ПУ-01 со скоростью 85-90 об/мин при температуре 30-32°С.

Нефть с водной поверхности экстрагировали четыреххлористым углеродом и проводили анализ на содержание остаточных углеводородов методом газовой хроматографии.

2.10 Изучение деструкции нефти биопрепаратом «мд» (сухой) в пробах сапропели методом ик-спектроскопии

2.10.1 Объекты и методы исследования

В работе использовались пробы сапропели, отобранные на водоемах г. Стрежевой (Томская область).

Был определён воздушно-сухой вес сапропели, который составил 19,1% от исходного и добавлена нефть до конечной концентрации 5% и 8% по воздушно-сухому весу. На одну повторность было использовано 2,5 кг сапропели. Были приготовлены следующие повторности:

1. Контроль 5% - пробы сапропели без добавления биопрепарата МД сухой и с добавлением нефти до конечной концентрации 5% в аэробных условиях (К5%);

2. Контроль 8% - пробы сапропели без добавления биопрепарата МД сухой и с добавлением нефти до конечной концентрации 8% в аэробных условиях (К8%);

3. Опыт 5%-№1 - пробы сапропели с добавлением биопрепарата МД сухой и с добавлением нефти до конечной концентрации 5% в аэробных условиях (5%-1);

4. Опыт 5%-№2 - пробы сапропели с добавлением биопрепарата МД сухой и с добавлением нефти до конечной концентрации 5% в аэробных условиях (5%-2);

5. Опыт 8%-№1 - пробы сапропели с добавлением биопрепарата МД сухой и с добавлением нефти до конечной концентрации 8% в аэробных условиях (8%-1);

6. Опыт 8%-№2 - пробы сапропели с добавлением биопрепарата МД сухой и с добавлением нефти до конечной концентрации 8% в аэробных условиях (8%-2);

7. Контроль 5% - пробы сапропели без добавления биопрепарата МД сухой и с добавлением нефти до конечной концентрации 5% в анаэробных условиях (К5% ан);

8. Контроль 8% - пробы сапропели без добавления биопрепарата МД сухой и с добавлением нефти до конечной концентрации 8% в анаэробных условиях (К8% ан);

9. Опыт 5% - пробы сапропели с добавлением биопрепарата МД сухой и с добавлением нефти до конечной концентрации 5% в анаэробных условиях (5%ан);

10. Опыт 8% - пробы сапропели с добавлением биопрепарата МД сухой и с добавлением нефти до конечной концентрации 8% в анаэробных условиях (8% ан).

В качестве загрязнителя использовали нефть Западно-Катыльгинского месторождения (г. Стрежевой, Томская область).

Отбор проб при инкубации в аэробных условиях производили с интервалом 14 дней, при анаэробных условиях – через 4 месяца.

При отборе проб определялась общая численность микроорганизмов методом предельных разведений на питательной среде мясо-пептонный бульон.

В пробирки с жидкой средой вносят 1 см³ из различных разведений питательного субстрата. После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался или отсутствовал рост, рассчитывают наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 см³ исследуемого субстрата.

Разведения исходной суспензии готовились следующим образом. Стерильную среду предварительно разливали в пенициллиновые флаконы и стерилизовали. Во флаконы наливали одинаковый объем среды. Посев проводили из каждого разведения, причем каждое разведение высевали в 2 повторностях (параллельных флаконах). Количество посевного материала везде одинаково и составляет 1 см³. Засеянные пробирки помещали в термостат. Время инкубации - 2 суток. После инкубации регистрировали рост микроорганизмов, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки, осадка, газа или накопление в среде определенных продуктов метаболизма.

Наиболее вероятное число микроорганизмов в единице объема рассчитывали по таблице Мак-Креди, разработанной на основании методов вариационной статистики.

При отборе проб определялось также содержание остаточных нефтепродуктов методом ИК-спектрометрии на приборе КН-3.