1. Хід визначення активності аспартатамінотрансферази (АсАт)

Дослідну пробу готують наступним чином. У пробірку вносять 0,5 мл субстратного розчину і прогрівають суміш при +37 ° С протягом 5 хв. Потім додають 0,1 мл випробуваної сироватки та пробірку поміщають у термостат при +37 ° С на 60 хв. Після вилучення її з термостата в вміст пробірки доливають 0,5 мл дінітрофенілгідразинового розчину, і проби витримують протягом 20 хв при кімнатній температуру для розвитку реакції. Потім додають 5 мл 0,4 н NaOH і після ретельного перемішування розчину залишають його при кімнатній температурі на 10 хв для розвитку забарвлення. Оптичну щільність проб вимірюють на ФЕКу із зеленим фільтром (530, 500-560 нм) у кюветі з шириною шару 10 мм. Результати порівнюють з аналогічними даними контрольних проб.

Контрольна проба на реактиви містить всі інгредієнти дослідної проби за винятком сироватки крові. Замість неї беруть 0,1 мл дистильованої води. Контрольну пробу інкубують в тих же умовах, що і дослідну.

Райтман, Френкель (1957) пропонують проводити контрольні проби для кожної сироватки. Контрольні проби ставлять так само, як дослідні, але розчин 2,4 дінітрофенілгідразину додають до їх інкубації. Здійснення контрольної проби для кожної, сироватки дає можливість отримувати більш точні результати.

2. Хід визначення активності аланінамінотрансферази (АлАт)

У пробірку вносять 0,5 мл субстратного розчину для дослідження АлАТ, потім додають 0,1 мл випробуваної сироватки і поміщають суміш на 30 хв у термостат для інкубації при +37 ° С.

Подальший хід аналізу здійснюють так само, як і при визначенні АсАТ.

В сироватці крові практично здорових людей активність аспартатамінотрансферази (АсАТ) складає 0,1-0,45 ммоль піровиноградної кислоти на 1 л сироватки ; активність аланінамінотрансферази (АлАТ) - 0,1 -0,68 ммоль / (ч * л).

5. Визначення вмісту білірубіну та його фракцій в сироватці крові колориметричним діазометодом (за Йендрашіку, Клеггорну, Грофом )

   Принцип методу: білірубін взаємодіє з діазореактивом з утворенням азобілірубіну рожевого кольору. Інтенсивність забарвлення розчину пропорційна концентрації білірубіну і може бути визначена фотометрично при зеленому світлофільтрі (довжина хвилі 530-560 нм). Кон’югований білірубін дає швидку (пряму) реакцію. Реакція некон’югованого білірубіну значно повільніша. Додаванням акселераторів (кофеїн та ін.) вільний білірубін можна перевести в розчинний стан і визначити кількість загального білірубіну. При використанні буферного розчину без акселераторів визначається кон’югований білірубін, а при використанні буферного розчину з акселераторами – загальний білірубін. Кількість некон’югованого білірубіну дорівнює різниці між кількістю загального і прямого білірубіну.

Визначення вмісту білірубіну рекомендують виконувати відразу ж після отримання проб, щоб попередити його окиснення на світлі; вплив прямого сонячного світла може бути причиною 50% зниження вмісту білірубіну вже через одну годину. Проби повинні бути проаналізовані протягом 2 год з моменту забору крові, якщо вони зберігаються при кімнатній температурі, і в темряві, або протягом 12 год при умові зберігання при температурі 2-8 С в темряві. Гемоліз еритроцитів прямо пропорційно знижує показники кількості білірубіну, який визначається у сироватці крові; виражена ліпемія обумовлює підвищені показники білірубіну.

Реактиви:

1) Кофеїновий реактив. 5 г чистого кофеїну, 7,5 г бензойнокислого натрію (C₆H₅COONa), 12,5 г кристалічного оцтовокислого натрію (CH₃COONa) розчиняють у 90 мл дистильованої води, нагрівають вміст колби до +50 - 60 ° С і добре перемішують. Після охолодження доводять дистильованою водою до 100 мл (деякі автори рекомендують доводити обсяг до 200 мл або до 1л). Розчин придатний протягом двох тижнів.

2) Фізіологічни розчин (розчин NaCl, 9 г / л).

3) Діазосуміш:

а) діазореактив I. 5 г сульфаніловой кислоти розчиняють при підігріванні, в 300-400 мл дистильованої води, додають 15 мл концентрованої соляної кислоти (щільність 1,19 кг / л). Якщо частина сульфаніловой кислоти залишається в осаді, колбу поміщають у теплу воду і її вміст помішують. Тільки після повного розчинення сульфаніловой кислоти та охолодження розчину обсяг колби доводять дистильованою водою до 1 л. Реактив стійкий, зберігається в посуді з темного скла;

б) діазореактив II. Розчин азотнокислого натрію (NaN0₂, 0,5 г/100 мл). Реактив нестійкий, міститься в склянці з темного скла близько 2-3 тижнів. Перша ознака його непридатності - поява жовтого відтінку.

Перед роботою змішують 10 мл діазореактива I і 0,3 мл діазореактива II.

Хід визначення. У три пробірки (для визначення загального білірубіну, зв'язаного білірубіну і постановки контрольної реакції на колір сироватки) вводять реактиви згідно зі схемою:

Реактиви	Схема досліду
	Загальний білірубін	Зв’язаний білірубін		Контроль
Сироватка	0,50	0,50	0,5
Кофеїновий реактив	1,75	-	1,75
Фізіологічний розчин	-	1,75	0,25
Діазосуміш	0,25	0,25	-

При визначенні загального білірубіну пробу для розвитку забарвлення залишають стояти на 20 хв. При подальшому стоянні проби забарвлення не змінюється.

Для дослідження зв’язаного білірубіну колориметрування здійснюють через 5-10 хв після додавання діазосуміші, так як при тривалому стоянні проби в реакцію вступає вільний білірубін.

Контрольну пробу на каламутність сироватки ставлять для кожної дослідної проби.

Колориметрують розчини на фотоелектроколориметрі при зеленому світофільтрі (довжина хвилі 500-560 нм) у кюветі з шириною шару 5 мм.

Розрахунок проводять по калібрувальному графіку. Знаходять вміст загального та зв'язаного білірубіну в мкмоль / л. Для визначення рівня незв'язаного (вільного) білірубіну з цифри загального його змісту віднімають показник зв'язаного білірубіну (прямого).

Вміст загального білірубіну становить у нормі 8,55 - 20,52 мкмоль / л (0,5 - 1,2 мг/100 мл). 75% припадає на частку вільного білірубіну.

У нормі вміст загального білірубіну становить 1,7-20,5 мкмоль/л (0,1-1,2 мг/100 мл), некон’югованого – 1,7-17,1 мкмоль/л (0,1-1,0 мг/100 мл), кон’югованого 0,86-4,30 мкмоль/л(0,05-0,25 мг/100 мл).

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Казмірчук В.Є. Навчальний посібник з клінічної імунології та алергології для аудиторної роботи студентів (2-е вид., доп ). – К. : ТОВ˝ Поліграф плюс ˝, 2008. – С. 158 – 163.

2. Мишин. В. Дифференциальная диагностика туберкулеза легких и внебольничной пневмонии // Врач. – 2002. – №3. – С. 6–9.

3. Накази МОЗ України №384 і № 385 від 09.06.2006 « Про затвердження інструкції щодо надання допомоги хворим на туберкульоз », « Протоколу надання першої медичної допомоги хворим на туберкульоз».

4. Наказ МОЗ України №233 від 29. 07. 96 ( Інструкція про застосування туберкулінових проб).

5. Пелещук А. П. Фізичні методи дослідження в клініці внутрішніх хвороб. – К. : Здоров’я, 1993. – С. 86 – 90.

6. Посібник з клінічної лабораторної діагностики / За ред. В. Г. Денисюка. – К. : Здоров’я, 1992 – С.154 – 160.

7. Справочник по лабораторным методам исследования / Под. ред. Л. Н. Даниловой. – СПб. : Питер, 2003. – С. 645 – 653.

8. Фещенко Ю. І. Сучасні методи діагностики, лікування і профілактики туберкульозу. – К. : Здоров’я, 2002. – С. 678–696.

10