Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

«Пермский национальный исследовательский

политехнический университет»

Факультет: химико-технологический

Кафедра «Химия и биотехнология»

Направление: 240100.62 «Биотехнология»

Лабораторная работа

«Полимеразная цепная реакция»

Выполнил студент

гр. БТ-11

Климов Н. А.

Проверил:

доцент Козлова Г.А.

Пермь, 2013 г.

Содержание

Теоретическая часть………………………………………….	3
Практическая часть …………………………………………….	8
Список литературы .................................................................................	19

Полимеразная цепная реакция.

Цель работы – закрепить знания по теме «полимеразная цепная реакция», ознакомиться с методами подбора праймеров как вручную, так и с использованием специализированных программ.

Теоретическая часть

Полимеразная цепная реакция - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов. [1].

Принцип избирательного умножения нуклеотидных последовательностей открыт в 1983 году K. Mullis, в то время являвшимся сотрудником американской биотехнологической компании “Cetus Copporation”. Официальное признание важности этого открытия состоялось уже через 10 лет, когда K. Mullis был удостоен Нобелевской премии. Фактически уже через 2 года на основе открытого принципа благодаря усилиям сотрудников этой фирмы был разработан метод ПЦР [2].

Праймеры – синтетические олигонуклеотиды, состоящие из 16–30 оснований. Они комплементарны участкам ДНК, между которыми находится последовательность-мишень. Праймер (англ. primer) является обязательным компонентом («затравка»), необходимым для работы ДНК-полимеразы: к его 3’-ОН концу фермент присоединяет нуклеотиды, комплементарные матрице.

Праймер к 5’-концу гена называют прямым (forward, For), к 3’-концу гена – обратным или встречным (reverse, Rev). В базах данных нуклеотидных последовательностей приведена только одна цепь ДНК – значащая, та, что транскрибируется в виде мРНК. По ней подбирают прямой праймер, т.е. тот праймер, от которого будет расти именно эта цепь. Обратный праймер подбирают для комплементарной цепи, но также в направлении 5’→3’.

В приведенной ниже работе требуется «вручную», без использования специальных программ подобрать праймеры для амплификации гена НАДН-дегидрогеназы гадюки Никольского (Viperanikolskii) и составить режим ПЦР [3].

Компоненты реакции

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

• ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

• Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

• Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermusaquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcusfuriosus (Pfu-полимераза),Pyrococcuswoesei (Pwo-полимераза) и другие.

• Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

• Ионы Mg²⁺, необходимые для работы полимеразы.

• Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию [3].