Сборка сэндвич-кассеты для заливки геля.
a) Поместите короткое стекло на стекло со спейсерами.
б) Скользящим движением поместите стекла в рамку для заливки гелей. Короткое стекло при этом должно быть спереди. Следите за тем, чтобы нижние части обоих стекол находились на одном уровне и касались поверхности.
с) Защелкните зажимы для закрепления стекол.
д) Поместите серую резиновую прокладку на подставку для заливки гелей, поставьте на нее кассету для заливки геля, зажатую в рамке и прижмите верхним зажимом. Перед заливкой геля убедитесь, что подставка установлена строго горизонтально, а стекла строго перпендикулярны уровню поверхности. Установите гребенку, с помощью маркера нанесите метку на стеклянной пластине на 3-5 мм ниже зубцов гребенки. Это будет уровень, до которого следует залить разделяющий гель. Выньте гребенку и приступайте к заливке гелей.
Формирование пааг (размер геля 8 х 7,3 см):
Разделяющий гель: для формирования разделяющего геля к 5 мл раствора для приготовления разделяющего геля добавьте 13 мкл раствора 10%-ного ТЕМЕД и 13 мкл раствора 10%-ного ПСА. С помощью пастеровской пипетки равномерно залейте приготовленный раствор до метки на стекле (границы разделяющего и концентрирующего геля). Сразу же после заливки для формирования ровной границы разделяющего геля на него следует наслаивать воду, изобутанол (насыщенный водой) или t-амиловый спирт. Наслаивать воду необходимо медленно и аккуратно, поддерживая равномерную скорость подачи для предотвращения смешивания. Затем оставьте гель для полимеризации на период от 40 мин до 1 ч. После чего полностью смойте покрывающий гель раствор дистиллированной водой. Это важно в случае использования спиртовых растворов при формировании ровной границы геля. Перед заливкой концентрирующего геля полностью высушите поверхность разделяющего геля с помощью фильтровальной бумаги.
Концентрирующий гель: Для формирования концентрирующего геля к 2,5 мл раствора для приготовления концентрирующего геля добавьте 13 мкл раствора 10%-ного ТЕМЕД и 13 мкл раствора 10%-ного ПСА. Приготовленный раствор геля заливайте до тех пор, пока его уровень не достигнет края стекла. Гребенку вставляйте под небольшим углом, чтобы предотвратить задержку воздуха под зубцами во время заливки раствора концентрирующего геля. Затем оставьте гель для полимеризации на 45-60 мин. Гребенку следует вынимать, подняв ее вертикально вверх медленно и осторожно. Тщательно промойте стенки лунок (карманов для проб) дистиллированной водой, не разрушив их целостности.
3. Сборка электрофоретического модуля:
-
а) Извлеките сэндвич кассеты с гелем из рамки для заливки геля, предварительно раскрыв зажимы.
б) Поместите сэндвичи кассет с гелем с обеих сторон на U-образный электродный блок (вместо одной из кассет можно использовать блокирующую пластиковую пластину). Короткое стекло при этом должно смотреть внутрь блока (во внутреннюю камеру).
с) Скользящим движением поместите U-образный электродный блок с двумя кассетами с гелем в фиксирующий каркас.
д) Прижмите электродный блок до упора и защелкните два зажима фиксирующего каркаса.
е) Поместите собранный внутренний блок в камеру.
Залейте во внутреннюю (верхнюю) камеру 125 мл буфера для электрофореза, так, чтобы граница буфера была выше верхнего края короткого стекла. Затем залейте 200 мл буфера для электрофореза в нижнюю камеру.