Значение

Молекулы могут переходить в возбужденное состоя­ние не только при поглощении квантов света, но и за счет химического взаимодействия с другими молекула-

84

ми. В последующем при переходе молекул в основное состояние может возникнуть свечение, называемое хемилюминесценцией. Спонтанная хемилюминесценция де­лится на три основных вида: митогенетическое излучение, биолюминесценция, или экзотическая люминесцен­ция, и сверхслабое свечение. Необходимым условием всех видов хемилюминесценции является химическая реакция окисления.

Митогенетическое излучение — это ультрафиолето­вое излучение (190—320 нм), субстратом которого слу­жат белки и углеводы. По мнению А. Г. Гурвича (1923), это излучение стимулирует клеточное деление.

Биолюминесценция — воспринимаемое глазом свече­ние (420—710 нм), присущее многим организмам (бак­териям, светлячкам, некоторым рыбам, грибам и про­стейшим). Во всех случаях биолюминесценция являет­ся результатом ферментативного окисления особых ве­ществ— люциферинов, молекулы которых при окисле­нии способны переходить в возбужденное состояние. Фермент, катализирующий окисление люциферинов, по­лучил название люциферазы. Природа люциферина в различных видах организмов может быть различной. Люциферин светлячков по своей природе близок к ри­бофлавину, а люциферин бактерий — к флавинмононуклеотиду.

В настоящее время люциферин и люцифераза выделены в чистом виде и свечение воспроизведено в раст­воре. Анализ кинетики реакции показал, что вначале образуется фермент-субстратный комплекс, после чего происходит окисление люциферина молекулярным кислородом. При окислении комплекс переходит в возбужденное состояние и способен испускать квант света.

Сверхслабое свечение, обнаруженное Б. Н. Тарусовым, А. И. Поливодой, А. И. Журавлевым в 1961 г.,— это излучение живых организмов, тканей, клеток, их гомогенатов и некоторых биосубстратов в видимой и инфракрасной области спектра (360—800 нм). Его мож­но зарегистрировать при помощи специального прием­ника излучения — фотоэлектронного умножителя с фотометрической установкой, работающей в режиме счетчика фотонов.

Введение объективного метода регистрации позво­лило установить, что сверхслабое свечение присуще многим реакциям в биологических объектах. Было вы-

85

яснено, что свечение сопровождает окислительные ре­акции экзотермического характера — в основном реак­ции цепного типа, развивающиеся по радикальному ме­ханизму (см. главу 4). Показано, что интенсивность свечения пропорциональна скорости рекомбинации сво­бодных радикалов. При взаимодействии двух радикалов их неспаренные электроны образуют пару или хими­ческую связь. В процессе образования этой связи, иду­щей через промежуточное возбужденное состояние, избыток электронной энергии высвечивается в (виде кван­та. Эти данные позволили применить метод регистра­ции свечения для исследования роли возбужденных со­стояний молекул в различных процессах и для анализа свободнорадикальных реакций. Б. Н. Тарусов и А. И. Журавлев показали, что свечение тканей связа­но с неферментативным окислением липидов, которое непрерывно протекает в норме во всех тканях и явля­ется одним из показателей гомеостаза. Свободнорадикальное окисление оказывает катаболическое действие на организм. Оно определяется, во-первых, конкурен­цией свободнорадикального окисления с ферментатив­ным окислением — дыханием, во-вторых, цитотоксическим действием. Продукты свободнорадикального окис­ления — альдегиды, кетоны, перекиси, радикалы — мо­гут оказывать деструктивное влияние на все системы и структуры клетки.

В организме свободнорадикальное окисление тор­мозится системой тканевых антиокислителей, в которую входят аскорбиновая кислота, адреналин, сульфгидрильные соединения, каротиноиды, токоферолы и фосфолипиды. Развитие цепного и свободнорадикального окисления в тканях может быть патогенетической ос­новой некоторых заболеваний. При этом сверхслабое свечение тканей может служить диагностическим те­стом (А. И. Журавлев, А. И. Журавлева, 1975). Наря­ду с этим при других заболеваниях изменения интен­сивности свечения могут дать дополнительную инфор­мацию о нарушении первичных физико-химических про­цессов в организме.

В последнее время были проведены исследования свечения плазмы и сыворотки крови в условиях стресса и при различных заболеваниях. При стрессе интенсив­ность свечения плазмы крови увеличивается, что указы­вает на усиление в крови активности свободнорадикаль-

86

ного окисления. При этом, по мнению А. И. Журавле­ва, продукты окисления усиливают деструктивные процессы в клетках. За повышенную энергетическую го­товность организм расплачивается временным усилением деструктивных процессов.

И. М. Бондарев с соавт. (1972) показали, что воспалительный процесс в легких сопровождается активиза­цией свободнорадикального окисления и соответствую­щим повышением уровня свечения сыворотки крови. При этом интенсивность свечения зависит от степени выраженности воспалительного процесса.

Изучение сверхслабого свечения сыворотки крови животных при злокачественных новообразованиях выявило фазные изменения уровня свечения. Сразу после перевивки опухоли и в течение нескольких суток люминесценция заметно усилена. Фаза развития опухоли ха­рактеризуется пониженной интенсивностью свечения крови. Исследования на больных людях выявили аналогичную закономерность: уровень свечения сыворотки крови больных злокачественными болезнями оказался пониженным по сравнению со свечением сыворотки крови здоровых людей. В период роста опухоли в ней происходит накопление антиокислителей, транспортируемых кровью из других органов. Повышенное содержа­ние антиокислителей в крови может быть одной из причин снижения интенсивности свечения сыворотки крови. Подавление свободнорадикального окисления в опухоли исключает возможность токсического действия продуктов окисления и тем самым способствует более быстрому росту опухоли. В фазе распада опухоли со­держание антиокислителей в сыворотке крови становится ниже, чем в норме. Свечение сыворотки также усиливается по сравнению с нормой.

Таким образом, интенсивность свечения сыворотки крови дает возможность диагностировать три основные фазы развития опухоли как фазы, по-разному влияю­щие на интенсивность радикального окисления.

Измерение интенсивности хемилюминесценции мож­но использовать для дифференциальной диагностики заболеваний легких. Изменение интенсивности свечения сыворотки крови туберкулезных и опухолевых живот­ных было противоположно направленным: повышенным у животных с туберкулезом легких и пониженным у животных с перевиваемой опухолью. Аналогичные ре-

87

зультаты были получены при исследовании больных людей. У больных туберкулезом легких независимо от его формы свечение сыворотки крови повышено по сравнению с нормой. У больных раком легкого свечение сыворотки крови оказалось ниже, чем у здоровых лиц.

МИГРАЦИЯ ЭНЕРГИИ

Энергия излучения, поглощенная одной молекулой, может быть передана другой, близко расположенной молекуле. Обычный путь переноса энергии в биологических системах — это диффузия богатых энергией фос­форных соединений, которая осуществляется в раство­рах. Однако существуют и другие пути переноса энер­гии. Эти пути — так называемая миграция энергии — имеют особенно важное значение в фотобиологических, радиобиологических и, возможно, в некоторых биохимических процессах. Миграция энергии — это безызлучательная передача энергии от молекулы к молекуле на расстояния, значительно превышающие межатомные, происходящая без растраты в тепло и без кинетических соударений донора и акцептора энергии.

Когда молекула поглощает энергию, то электрон с основного энергетического уровня переходит на более высокий, возбужденный уровень. При движении этих электронов по орбитам в молекуле создается перемен­ное электромагнитное поле. Частота колебаний этого поля определяется энергетическим уровнем возбужден­ного электрона. Если рядом с возбужденной молекулой находится невозбужденная молекула, которая имеет энергетический уровень, совпадающий или несколько меньший уровня возбужденной молекулы, то возникает явление резонанса. При этом невозбужденная молеку­ла возбуждается, а возбужденная — переходит в невозбужденное состояние, т. е. энергия возбужденной моле­кулы почти целиком передается невозбужденной моле­куле. Это бывает тогда, когда частота испускаемых электромагнитных колебаний донора энергии совпадает с частотой колебаний акцептора энергии. Схематически описанные процессы можно изобразить так:

Для возникновения миграции необходимы следующие условия:

88

1. Донор энергии должен обладать способностью к созданию распространяющегося электромагнитного по­ля, т. е. способностью к люминесценции.

2. Частота колебаний электромагнитного поля доно­ра должна совпадать с частотой колебаний акцептора. Для этого необходимо, чтобы спектр люминесценции донора перекрывался со спектром поглощения акцеп­тора.

3. Необходимо, чтобы донор и акцептор были сближены на достаточное расстояние. Вероятность миграции резко уменьшается при увеличении расстояния между молекулами (вероятность миграции обратно пропорци­ональна расстоянию между молекулами в шестой сте­пени). Поэтому эффективная миграция происходит, если донор и акцептор достаточно сближены (1—10 нм).

Миграция энергии возбуждения может наблюдаться как по синглетным, так и по триплетным уровням. Направление миграции обусловлено вторым законом термодинамики и всегда соответствует переходу электронов с более высокого уровня в доноре на более низкий в акцепторе.

Наличие миграции определяют с помощью спектральных методов. Если обнаруживается, что вещество, непосредственно не участвующее в фотохимической ре­акции, начинает люминесцировать (сенсибилизирован­ная люминесценция), то это говорит о наличии мигра­ции энергии, т. е. о том, что молекулы этого вещества получили энергию от других молекул, непосредственно участвующих в поглощении света.

Рассмотренный тип миграции энергии называется резонансным, поскольку он осуществляется в результа­те резонанса донора и акцептора энергии. Эффектив­ность (вероятность) миграции энергии резонансным способом у белков составляет всего несколько процен­тов, поэтому данный вид переноса энергии для них су­щественного значения не имеет. Эффективность резо­нансной миграции энергии для нуклеиновых кислот до­стигает 30%. Резонансная миграция энергии может достигать 100% в системах с высокой концентрацией хромофоров —соединений, содержащих систему сопря­женных кратных связей.

В некоторых случаях возбужденный электрон может перемещаться от одной молекулы к другой вдоль возбужденного уровня. «Дырка», возникающая после ухо-

89

да электрона, может перемещаться вслед за ним по этому уровню. Такая перемещающаяся пара электрон— «дырка» называется экситоном, а миграция энергии, осуществляющаяся с помощью экситона, называется экситонной миграцией. В отличие от резонансной экситонная миграция энергии может осуществляться на сравнительно большие расстояния.

Экситонная теория была применена при рассмотрении переноса энергии в системах, содержащих биоло­гические пигменты: родопсин, хлорофилл и др. Предпо­лагают, что в процессе фотосинтеза хлоропласты могут функционировать как своеобразные полупроводниковые образования. Поглощение света может приводить к об­разованию в молекуле хлорофилла свободных электро­нов и положительных «дырок». Электроны и «дырки» движутся и обусловливают окислительно-восстанови­тельные процессы. Электрон может осуществлять восста­новление какого-либо акцептора, так как восстановле­ние — это присоединение молекулой электронов. «Дыр­ка» может осуществлять окисление молекул, так как присоединение «дырки» означает отдачу электрона, т. е. окисление.

ДЕЙСТВИЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА БЕЛКИ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Выяснение механизма действия ультрафиолетового излучения на белки и нуклеиновые кислоты имеет важное общебиологическое значение. С момента возникно­вения жизни на Земле доклеточные образования и од­ноклеточные организмы находились под сильным влия­нием ультрафиолетового излучения. Под постоянным воздействием ультрафиолетовых лучей находятся жи­вые организмы и в настоящее время. Ультрафиолетовое облучение, приводящее к гибели клеток, появлению мутаций или инактивации клеток, имеет важное практическое значение в медицине, генетике микроорганизмов и т. д. Представляет интерес и проблема стимулирую­щего действия ультрафиолетового излучения на био­логические и ферментативные процессы синтеза ве­ществ.

Спектр ультрафиолетового излучения Солнца разделяют на три области: 1) 180—275 нм — коротковолно-

90

вое излучение. Изменяет структуру белков и липоидов, оказывает бактерицидное действие; 2) 275—320 нм — средневолновое излучение. Оказывает антирахитиче­ское и пигментообразующее действие, усиливает обра­зование эпителия, стимулирует процессы регенерации в организмах; 3) 320—400 нм — длинноволновое излуче­ние. Оказывает слабое биологическое действие, вызыва­ет люминесценцию некоторых органических веществ.

Ультрафиолетовое излучение может вызвать такие фотобиологические реакции, которые приводят к деструкции белков и нуклеиновых кислот. Эти фотобиологические реакции вызывают и вторичные изменения, уже не связанные с непосредственным действием излу­чения. Первичные изменения состоят в нарушении структуры ДНК и в денатурации белков. Вторичные из­менения наступают вследствие того, что клеточные фер­менты расщепляют денатурированный белок. При этом накапливаются продукты распада. Продукты распада вызывают раздражение нервных окончаний, которое приводит к сложным рефлекторным реакциям.

Каков же механизм действия ультрафиолетового излучения на белки? При действии излучения на раство­ры белков наблюдается помутнение раствора, измене­ние вязкости, изменение скорости оседания в центрифу­ге, изменение оптического вращения. Короче говоря, появляются все признаки денатурации белка. При денатурации белков, как известно, их ферментативные свой­ства нарушаются и исчезают. Если облучать биологиче­ски активные белки или полипептиды: ферменты, анти­тела, гормоны, антибиотики, то уже через несколько минут облучения биологическая активность этих ве­ществ резко падает.

Механизм действия ультрафиолетового излучения на белки был раскрыт в основном в работах Ю. А. Владимирова. Поглощение света белками в области 260 — 280 нм обусловлено ароматическими аминокислотами: тирозином и триптофаном. Эти аминокислоты поглоща­ют ультрафиолетовое излучение и разрушаются. Разру­шение данных аминокислот приводит к денатурации белков и к инактивации их ферментативной активности. Весь процесс протекает в несколько стадий.

1. Активная стадия — поглощение света и возбуждение молекулы аминокислоты АН:

₉₁

Этот процесс обратим, т. е. возбужденная молекула мо­жет люминесцировать и снова переходить в невозбуж­денное состояние:

где, согласно закону Стокса, v₁>v₂.

2. С тадия фотоионизации — возбужденная молекула является неустойчивой и распадается на электрон и ион- радикал:

Электрон захватывается другими молекулами, в основ­ном воды, и сольватируется. Ион-радикал является неустойчивым соединением и распадается на свободный радикал и ядро атома водорода (протон):

Все эти процессы протекают очень быстро и исследу­ются с помощью метода импульсной спектрофотометрии при низких температурах.

3. Стадия реакция образовавшихся радикалов и сольватированного электрона. Данная стадия может

и меть несколько направлений:

а) Образовавшийся радикал аминокислоты А взаимодействует с соседними звеньями пептидной цепи бел­ковой молекулы. Это вызывает изменение конфигурации белковой молекулы. Так как радикалы в химическом отношении очень активны, то образовавшаяся связь бывает прочной, и нарушенная конфигурация белковой молекулы закрепляется. Нарушение конфигурации молекулы (изменение третичной и вторичной структуры) уже на этом этапе приводит к инактивации ферментативных свойств, особенно в связи с тем, что ароматические аминокислоты часто входят в состав активных центров ферментов.

б) Свободный радикал аминокислоты может взаимодействовать с кислородом и образовывать перекисный радикал аминокислоты:

в) Сольватированный электрон является исключительно сильным восстановителем. Ион водорода — протон — также в химическом отношении очень активен.

₉₂

Они взаимодействуют с аминокислотными остатками белковой молекулы. При этом образуются аммиак и радикалы аминокислот:

В результате этого процесса происходит разрушение звеньев белковой молекулы.

4. Стадия образования устойчивых продуктов окисления. Все образовавшиеся радикалы аминокислот вза­имодействуют с различными веществами. Через цикл реакций, которые пока еще слабо изучены, образуют­ся устойчивые продукты окисления. Эти образовавшие­ся продукты обладают токсическими свойствами. Они взаимодействуют с молекулами белка и также нару­шают их структуру.

В ультрафиолетовой области спектра (260 нм) силь­но поглощают лучи только азотистые основания нуклеиновых кислот. По этой причине именно они подверга­ются фотохимическим превращениям при ультрафиоле­товом облучении. Наиболее важные реакции, идущие под действием ультрафиолетового излучения, это фото­химическое окисление, фотохимическое гидрирование (присоединение молекул воды к азотистым основаниям) и фотодимеризация. Фотодимеризация заключается в образовании устойчивой химической связи между дву­мя азотистыми основаниями под действием фотонов. При большой дозе ультрафиолетового облучения может происходить разрыв колец азотистых оснований.

Основное действие ультрафиолетовых лучей на нуклеиновую кислоту заключается в том, что последняя те­ряет биологическую активность, т. е. способность передавать заключенную в ней информацию. При этом основную роль в инактивации ДНК играют процессы димеризации тиминовых оснований. Процессы димеризации тиминовых оснований протекают раньше других фотохимических реакций. Когда еще не наблюдается за­метного накопления гидрированных и окисленных осно­ваний, инактивация ДНК уже происходит. Две молеку­лы тимина в двойной спирали ДНК никогда не распо­ложены рядом. Более того, в силу комплементарное™ нитей в ДНК они никогда не расположены точно на­против друг друга. Под воздействием ультрафиолето­вых лучей возникает местное расплетение нитей ДНК. Затем нити изгибаются таким образом, что тиминовые

93

основания сближаются. Между ними возникает стойкая химическая связь, которая как бы стягивает двой­ную нить ДНК и препятствует считыванию с нее ин­формации.

Ультрафиолетовое излучение оказывает сильное бактериостатическое и бактерицидное действие. При облучении ультрафиолетовыми лучами бактерий и вирусов происходит угнетение их активности, подавле­ние способности к размножению и гибель. Механизм действия ультрафиолетового излучения на бактерии и вирусы был выявлен при изучении спектров действия инактивации этих организмов. Под спектром действия понимают зависимость величины фотобиологического эффекта от длины волны излучения. Оказалось, что спектр действия инактивации при ультрафиолетовом облучении вирусов и бактерий совпадает со спектром поглощения нуклеиновых кислот (У. Винклер, 1962). Следовательно, основой бактерицидного действия ультрафиолетовых лучей является повреждение и инактивация нуклеиновых кислот. Для бактерий, кроме того, определенное значение имеет и повреждение фермент­ных систем.

Другая картина была получена при исследовании влияния ультрафиолетовых лучей на клетки млекопитающих. Для них излучения с длиной волны 260 и 280 нм обладают почти одинаковой эффективностью. Это ука­зывает на то, что в клетках млекопитающих фотохимическое повреждение белков так же существенно, как и повреждение ДНК (И. П. Арман, 1971).

Бактерицидное действие ультрафиолетового излуче­ния широко используется в лечебных и профилактиче­ских целях, для облучения участков тела, содержащих инфекцию, для стерилизации различных предметов, веществ, продуктов питания и т. п.

Вредное влияние на организм человека оказывают лишь большие дозы облучения коротковолновыми лу­чами. Умеренные дозы ультрафиолетового облучения повышают общую и иммунную реактивность организма, что позволяет применять ультрафиолетовые лучи с ле­чебными и профилактическими целями. Особое значе­ние ультрафиолетовое облучение имеет в процессе образования витамина D из 7,8-дегидрохолестерина и эргостерина. Облучение кожи вызывает разрыв двойной связи в кольце, что приводит к проявлению антирахи-

94

тических свойств этого витамина. Длительное пребывание в условиях, исключающих ультрафиолетовое об­лучение, приводит к подавлению синтеза витамина D и к развитию нарушений фосфорно-кальциевого обмена.