Глава 8 электрокинетические явления

Биологические объекты представляют собой сложные гетерогенные системы со множеством границ раздела. С одной стороны, отдельная клетка представляет собой коллоидную гетерогенную систему, образованную высо­комолекулярными и низкомолекулярными соединениями. С другой стороны, ткань можно считать гетерогенной системой более высокого порядка, где дисперсная фаза и дисперсионная среда представлены соответственно клетками и окружающей их жидкостью. С этой точки зрения изучение электрокинетических явлений, проте­кающих в биологических системах, представляет боль­шой интерес при исследовании структур и биологических поверхностей.

К электрокинетическим явлениям относят движение фаз гетерогенной системы друг относительно друга при наложении внешнего электрического поля ,или же воз­никновение разности потенциалов в системе при меха­ническом движении фаз под действием каких-либо сил. К таким явлениям относятся электрофорез, электроосмос, потенциалы течения (протекания) и потенциалы оседа­ния (седиментации).

ВОЗНИКНОВЕНИЕ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА

При определенных условиях между фазами гетеро­генной системы на границе раздела возникает разность потенциалов. Для ее возникновения необходимо наличие двойного электрического, слоя. Образование его связано с возникновением на поверхности дисперсной фазы сво­бодных электрических зарядов. Электрические заряды на поверхности коллоидных частиц или на поверхности клеток и клеточных органоидов могут возникать в ре­зультате двух процессов: диссоциации ионогенных групп и адсорбции ионов дисперсионной среды на поверхности дисперсной фазы, которая сама не способна образовы­вать ионы.

Возникновение поверхностного заряда за счет иони­зации может, например, происходить в белках и других

197

органических электролитах, содержащих карбоксильные, аминные и другие полярные диссоциирующие группы. В белковых молекулах возникновение заряда зависит от наличия кислотных и щелочных группировок. Кислотные группировки в молекуле белка создаются, помимо кон­цевых аминокислот, дикарбоновыми аминокислотами, щелочные — диаминомонокарбоновыми кислотами. Бла­годаря наличию кислотных и щелочных групп белки представляют собой биполярные ионы. В кислых раство­рах белок играет роль катиона.

Например, при действии НС1 происходит реакция:

При действии NаОН происходит такая реакция:

В результате ионизации групп NH₂ и СООН одни ионы — так называемые противоионы — уходят в дис­персионную среду, а другие — потенциалообразующие ионы — остаются фиксированными на поверхности, со­держащей данные молекулы белка. Поверхность, содер­жащая белки, будет иметь, таким образом, заряд того знака, который имеют потенциалобразующие фиксиро­ванные ионы (NНз⁺ в первом случае и СОО- — во вто­ром), а дисперсионная среда будет иметь заряд, созда­ваемый противоионами. Такая группа (система) ионов, в целом нейтральная, называется двойным электриче­ским слоем.

Вторым процессом, ведущим к образованию двойного электрического слоя, является адсорбция ионов поверх­ностью дисперсной фазы из дисперсионной среды. Адсорбция ионов может происходить на полисахаридах, липидах, холестерине, белках. Адсорбция ионов сильно связана с наличием полярных недиссоциирующих групп: гидроксильных, карбонильных, пептидных и пр. Адсор-

198

бироваться могут как катио­ны, так и анионы, однако преимущественно адсорби­руются анионы, что связано с их меньшей степенью гид­ратации. Ионы, которые ад­сорбируются поверхностью, являются потенциалобразу-ющими — от них зависит знак заряда поверхности; в дисперсионной среде оста­ются противоионы, которые и определяют ее заряд.

Структура двойного

электрического слоя не за­висит от механизма возник­новения заряда на поверх­ности, т. е. от того, происхо­дит ли образование заряда путем диссоциации ионогенных групп или за счет ад­сорбции ионов из раствора.

Но современным представлениям, двойной электри­ческий слой имеет примерно следующее строение. Часть ионов находится на молекулярном расстоянии от по­верхности, образуя плотный гельмгольцевский слой. Этот слой состоит из потенциалообразующих ионов и некото­рой части противоионов (рис. 35, а). Противоионы удерживаются на поверхности частицы силами специфи­ческой адсорбции, поэтому этот слой называется адсорб­ционным слоем. Противоионы адсорбционного слоя всег­да перемещаются вместе с частицами дисперсной фазы. Остальная часть противоионов, не находящихся в ад­сорбционном слое, остается в дисперсионной среде и об­разуется так называемый диффузионный слой. Диффу­зионный слой может отставать от движения частицы с адсорбционным слоем.

Полная разность потенциалов Е (рис. 35, б) между дисперсной фазой и дисперсионной средой называется полным электротермодинамическим потенциалом. Раз­ность потенциалов ξ (ξ-потенциал) между адсорб­ционным слоем и дисперсионной средой называется элек­трокинетическим потенциалом, ξ-потенциал всегда мень­ше термодинамического потенциала, и это уменьшение

199

обусловлено присутствием части противоионов в ад­сорбционном слое (по существу в дисперсной фазе).

Любые факторы, влияющие на строение двойного электрического слоя, изменяют величину ξ-потенциала. При увеличении концентрации ионов в дисперсионной среде толщина диффузионного слоя уменьшается и уменьшается ξ-потенциал. Если двойной электрический слой возникает в результате диссоциации ионогенных групп, то величина электрокинетического потенциала в большой степени будет зависеть от рН дисперсионной среды.

Электрокинетический потенциал возникает в очень тонком слое жидкости, прилегающем непосредственно к поверхности дисперсной фазы, поэтому его нельзя за­регистрировать с помощью электродов. Величину ξ-по­тенциала можно рассчитать только косвенно, по скоро­сти движения фаз в электрическом поле.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Если к гетерогенной системе приложить постоянную разность потенциалов, то фазы этой системы придут в движение вследствие взаимодействия с электрическим полем. Движение частиц дисперсной фазы в электриче­ском поле по направлению к противоположно заряжен­ному электроду называется электрофорезом. Электрофо­рез был открыт Ф. Рейссом в 1807 г.

Скорость передвижения частиц дисперсной фазы можно найти из уравнения Смолуховского:

где v — скорость передвижения частиц; ε — диэлектри­ческая проницаемость дисперсионной среды; Е — гра­диент потенциала внешнего электрического поля; ξ — электрокинетический потенциал; ή — коэффициент вязкости дисперсионной среды.

Уравнение (1) применимо в тех случаях, когда раз­меры частиц значительно превышают толщину двойного электрического слоя, составляющую доли нанометра. Оно полностью применимо для эритроцитов, лейкоцитов, микроорганизмов и других клеток. Для белковых моле­кул и коллоидных частиц, размер которых сравним с

200

толщиной двойного электрического слоя, электрофоретическая подвижность зависит от их размера и формы. Для расчетов в уравнение (1) вводят коэффициент, зависящий от размера и формы частиц. Уравнение (1) применяется для вычисления ве­личины электрокинетического потенциала. Для этого необходимо знать напряженность внешнего поля, диэлек­трическую проницаемость и коэффициент вязкости сре­ды, а также скорость движения дисперсной фазы.

Обычно применяют два метода электрофореза: макро- и микроэлектрофорез. Один из макрометодов электрофореза заключается в следующем. Исследуемую дисперсную систему помещают на дно У-образной трубки и наливают над ней в боковые колена чистый буферный раствор для того, чтобы электрофорез проис­ходил при постоянном рН. При этом добиваются, чтобы между исследуемой жидкостью и буферным раствором имелась отчетливая граница раздела. Погружают в каж­дое колено У-образной трубки электроды, соединенные с источником постоянного тока. Создаваемое электриче­ское поле вызывает перемещение дисперсной фазы иссле­дуемого раствора, и граница между дисперсной систе­мой и буферным раствором перемещается. Перемещение границы регистрируется с помощью длиннофокусной оптики. Если исследуемая смесь содержит несколько компонентов, то каждый компонент движется со ско­ростью, пропорциональной величине ξ-потенциала. В ре­зультате этого смесь разделяется на ряд фракций. При регистрации получается кривая, имеющая ряд пиков, где высота пиков служит количественным показателем данных фракций.

С помощью описанного метода удается выделить и исследовать, например, отдельные фракции белков кро­вяной плазмы. Данный метод получил особенно широкое распространение после разработки техники этого метода Тизелиусом. Для диагностики многих заболеваний необ­ходимо производить качественный и количественный анализ фракций белков кровяной плазмы. В связи с этим методы электрофореза широко применяются в клинико- лабораторной практике.

В настоящее время более широко применяется менее точный, но более простой метод электрофореза на бума­ге, предложенный Виландом и Фишером. На специаль­ную фильтровальную бумагу, смоченную буферным ра-

201

створом, наносят определенное количество исследуемо­го раствора. Концы этой полоски бумаги соединяют че­рез ванночки, заполненные буфером, с угольными элек­тродами и источником постоянного тока. При включении тока происходит электрофоретическое перемещение ком­понентов исследуемой смеси. Электрофоретическая по­движность в соответствии с уравнением (1) пропорцио­нальна величине ξ-потенциала отдельных компонентов. После окончания опыта исследуемые вещества в зависи­мости от величины электрофоретической подвижности и величины взаимодействия с бумагой располагаются на различном расстоянии от линии нанесения — линии старта. Ленту бумаги высушивают и окрашивают кра­сителем, проявляющим исследуемые вещества. В даль­нейшем разделенные компоненты подвергают количест­венному определению путем фотометрирования.

Макрометоды электрофореза применяют в основном для разделения и исследования электрохимических свойств коллоидных растворов. Для изучения электрохи­мических свойств суспензий различных клеток: эритро­цитов, лейкоцитов, бактерий, половых клеток и пр., а также клеточных органоидов — значительно более при­годны микрометоды электрофореза. При этом суспен­зии клеток в небольшом количестве помещают в спе­циальную камеру, заполненную буферным раствором. В эту камеру вводят также электроды, соединенные с источником постоянного тока. Под действием электри­ческого поля клетки начинают двигаться к противопо­ложно заряженному электроду. Скорость перемещения клеток определяется с помощью микроскопа, снабжен­ного окулярным микрометром.

С помощью методов электрофореза получены важные-данные, характеризующие электрохимические свой­ства биологических поверхностей. На основе многочис­ленных экспериментов установлено, что живая прото-плазматическая поверхность всегда заряжена отрица­тельно, т. е. все биологические поверхности обладают отрицательным электрокинетическим потенциалом. Не из­вестно ни одного примера ясно выраженного положи­тельного потенциала поверхности живого объекта.

Величина ξ-потенциала может иметь различные зна­чения для разных клеток. Большое количество работ по­священо изучению ξ-потенциала эритроцитов. Величина ξ-потенциала эритроцитов у различных млекопитающих.

202

при рН 7,4 колеблется от 7 до 22 мВ. У человека она составляет в данных условиях 16,3 мВ. ξ-Потенциал эритроцитов — очень стабильная величина. В пределах одного вида, например у человека, нет никаких разли­чий в величине ξ-потенциала эритроцитов у представите­лей различных рас и пола. Они не наблюдаются также между представителями разных групп крови. Электрофоретическая подвижность эритроцитов не изменяется при ряде заболеваний крови, в том числе при многих фор­мах анемий.

ξ-потенциал эритроцитов сохраняет свою величину да­же после их полного гемолиза. Можно отметить, что электрохимические свойства поверхности эритроцитов отличаются большой стойкостью и постоянством, ξ-потен­циал эритроцитов зависит от рН. Изоэлектрическая точка эритроцитов соответствует рН 1,7, что не совпадает ни с изоэлектрической точкой гемоглобина (рН 6,8), ни с изоэлектрической точкой белков плазмы (рН 4,7). Ана­лизируя приведенные данные и учитывая химический состав оболочек эритроцитов, ученые пришли к выводу, что электрокинетический потенциал эритроцитов обус­ловлен диссоциацией кислотных групп молекул фосфолипидов (кефалина) на поверхности эритроцитов и не связан с процессами адсорбции белков и ионов. Вели­чина электрокинетического потенциала эритроцитов ме­няется в том случае, если происходит изменение физико-химического состава самой поверхности клетки. Это наб­людается при некоторых заболеваниях, например гемобластозах, лимфосаркоме.

Для других форменных элементов крови ξ-потенциал изучен значительно слабее, чем для эритроцитов. Лейко­циты при электрофорезе, как и эритроциты, движутся к аноду, но их подвижность примерно в 2 раза ниже по­движности эритроцитов. Электрофоретическая подвиж­ность лейкоцитов весьма близка к подвижности кварце­вых частиц, адсорбировавших на своей поверхности мо­лекулы сывороточных белков. Это делает вероятным предположение, что электрокинетический потенциал лейкоцитов обусловлен диссоциацией ионогенных групп белков сыворотки крови, адсорбированных на поверх­ности лейкоцитов.

По мнению Г. Абрамсона, явление электрофореза наблюдается при миграции лейкоцитов в воспалитель­ные очаги. Хотя лейкоциты обладают активным хемотак-

203

сическим движением, электрокинетические явления мо­гут способствовать миграции лейкоцитов. В воспаленных участках происходят процессы разрушения структур и накопления свободных молекул, главным образом орга­нических кислот, что приводит к сдвигу рН в кислую сторону (до рН 6,2—6,5). В результате этих физико-хи­мических изменений пограничный участок между воспа­ленной и невоспаленной тканью приобретает избыточный положительный потенциал величиной до 100 — 150 мВ. А так как лейкоциты обладают отрицательным электро­кинетическим потенциалом, то они движутся через стен­ку капилляра в ткань по направлению к положительно заряженному воспаленному участку.

Большое количество работ посвящено исследованию электрокинетического потенциала бактериальных клеток. Бактериальные клетки обладают отрицательным ξ-по­тенциалом, который может меняться в очень широких пределах: от нуля до десятков милливольт. Благодаря изучению зависимости ξ-потенциала от рН среды боль­шинство бактерий удалось разделить на две группы. К первой группе принадлежат бактерии, поверхность ко­торых имеет белковую природу. Диссоциация ионогенных групп белковых молекул обусловливает заряд и ξ-потенциал таких клеток, ξ-потенциал этих клеток меня­ется при изменении рН среды, так как степень диссо­циации ионогенных групп зависит от рН. Ко второй группе относятся бактерии, поверхность которых состоит из полисахаридов. Заряд клеток в данном случае обус­ловлен адсорбцией ионов из дисперсионной среды поли­сахаридами поверхности. Электрофоретическая под­вижность таких клеток практически не зависит от рН среды.

Однако такое деление оказывается довольно услов­ным, так как свойства поверхности бактериальных кле­ток могут изменяться при изменении внешних условий существования. Так, например, ξ-потенциал золотистога стафилококка при обычных условиях культивирования остается постоянным при большом изменении рН среды.

Если же бактерии культивируются в среде, богатой глюкозой, то наблюдается зависимость ξ-потенциала от величины рН. Это, по мнению многих авторов, следствие накопления на поверхности клеток ионогенных групп белковой природы.

204

Таким образом, метод электрофореза является хоро­шим средством изучения электрохимических свойств биологических поверхностей: способности к ионизации и способности к адсорбции молекул и ионов.