Потенциал покоя

Между внутренней и наружной поверхностями клеточной мембраны всегда существует разность электрических потенциалов. Эта разность потенциалов, изме-

172

ренная в состоянии физиологического покоя клетки, называется потенциалом покоя. Потенциал покоя клетки можно измерить с помощью стеклянного микроэлектрода, введенного непосредственно в цитоплазму; второй электрод при этом находится во внеклеточной жидкости. Кончик микроэлектрода, имеющего внутри канал, заполненный концентрированным раствором КСl, может иметь диаметр всего в долю микрона. При введении микроэлектрода мембрана клетки охватывает его кончик и ее повреждения практически не происходит. Основные работы по выяснению механизмов возникновения био­потенциалов были выполнены на крупных клетках: ги­гантских аксонах кальмаров, клетках водоросли Nitella и др. Эти клетки могут иметь диаметр до 1 мм, что очень удобно для исследования.

На основании большого экспериментального материа­ла было установлено, что цитоплазма в состоянии покоя

клеток всегда имеет отрицательный потенциал по отно­шению к потенциалу межклеточной жидкости. Потен­циал покоя у разных клеток имеет величину от 50 до 100 мВ. В табл. 3 приведены значения потенциала по­коя для некоторых клеток.

Согласно современным взглядам, причиной возникновения потенциалов клеток как в покое, так и при возбуждении является неравномерное распределение ионов калия и натрия между содержимым клеток и окружающей средой. Как уже указывалось в главе 6, концент­рация ионов калия внутри клеток в 20 — 40 раз превышает их содержание в окружающей клетку жидкости-

173

Напротив, концентрация натрия в межклеточной жид-кости в 10 — 20 раз выше, чем внутри клеток. Такое не-равномерное распределение ионов обусловлено актив­ным переносом ионов — работой натрий-калиевого насоса (см. главу 6).

Как было установлено, возникновение 'потенциала по­коя обусловлено в основном наличием концентрацион_: ного градиента ионов калия. Эта точка зрения базиру­ется на том, что ионы калия внутри клетки находятся в свободном состоянии, т. е. не связаны с другими ионами и молекулами и могут свободно диффундировать. Иссле­дования Ходжкина и Кейнеса (1953), выполненные с радиоактивным ⁴²К на гигантских аксонах кальмара, по­казали, что подвижность и коэффициент диффузии ⁴²К внутри волокна -почти такие же, как и в водном ра­створе. Хинке (1961) установил, что коэффициент ак­тивности калия в аксоплазме такой же, как и в морской воде. Гаррис (1954) показал, что электрическая подвиж­ность ⁴²К в мышечном волокне лягушки также оказа­лась близкой к подвижности в водном растворе. Нако­нец, на то, что калий в цитоплазме находится в свобод­ном состоянии, указывает и высокое значение электропро­водности аксоплазмы —0,5>0,8 электропроводности мор­ской воды.

Избыток положительных зарядов ионов калия внутри клеток компенсируется в основном органическими анио­нами. К ним относятся анионы аспарагиновой, уксусной, пировиноградной и других органических кислот. Содер­жание неорганических анионов в клетках сравнительно небольшое.

Согласно теории Ходжкина, Хаксли, Катца, клеточ ная мембрана в состоянии покоя проницаема в основ-ном только для ионов калия. Ионы калия диффунди-руют по концентрационному градиенту через клеточную

мембрану в окружающую жидкость; анионы не могут

проникать через мембрану и остаються на ее внутренней

стороне. Так как ионы калия имеют положительный за-ряд. а анионы, остающиеся на внутренней поверхности мембраны, — отрицательный, то внешняя — поверхность мембраны при этом заряжается положительно, а внут-ренняя — отрицательно (рис. 29). Понятно, что диффу-зия продолжается только до того момента, пока не установится равновесие между силами возникающего электрического поля и силами диффузии.

174

Рис 29. Влияние диффузии ионов калия, натрия и хлора на мембран­ный потенциал клеток.

Если принять, что потенциал покоя определяется диффузией только ионов калия из цитоплазмы наружу, то его величина Е может быть найдена из уравнения Нернста:

(5)

где [К]_i и [К]_е—активность ионов калия внутри и сна­ружи клетки.

Разность потенциалов между внутренней и наруж­ной поверхностями мембраны различных клеток, рассчи­танная по уравнению Нернста, оказалась очень близкой к измеренной в опыте с помощью внутриклеточных микроэлектродов. Кроме того, калиевый механизм воз­никновения потенциала покоя убедительно подтверж­дают эксперименты с изменением концентрации калия в окружающей клетку среде. При изменении наружной концентрации калия в широких пределах наблюдалось закономерное изменение величины потенциала покоя в соответствии с зависимостью, выраженной уравнением (5). В частности, когда концентрацию калия в окружающей клетку жидкости делали равной концентрации в клетке, потенциал покоя становился равным нулю.

Вторым фактором пропорциональности в уравнении (5) служит абсолютная температура. Величина потен­циала покоя по теории должна быть прямо пропорцио­нальной абсолютной температуре. Еще в прошлом веке было показано, что локальное согревание участка нерва делает его электроположительным по отношению к дру­гим участкам, что качественно подтверждает справедли­вость уравнения (5) в его применении к описанию по­тенциала покоя клеток. Точные измерения Линга и дру­гих авторов показали, что температурный коэффициент

175

Q₁₀ потенциала покоя клеток равен примерно 1,1. Такой температурный коэффициент характерен для физических процессов (см. главу 4). Таким образом, температурные зависимости потенциала покоя подтвердили, что в осно­ве его возникновения лежит физический процесс, в част­ности диффузия.

При более точном измерении потенциала покоя вы­яснилось, что во многих случаях его измеренное значе­ние соответствует значению, теоретически вычисленному по уравнению (5); в других случаях между измеренной и вычисленной величинами имеются значительные отли­чия. Это объясняется тем, что на величину потенциала покоя оказывает влияние диффузия других ионов.

Мембрана в состоянии покоя проницаема не только для ионного калия, но и в небольшой степени для ионов натрия и хлора. Мембранный потенциал клеток представляет собой результирующую электродвижущих сил, генерируемых всеми этими тремя каналами диффузии. Проникновение натрия из окружающей жидкости внутрь клетки по концентрационному градиенту приводит к не­ которому уменьшению мембранного потенциала (см. рис. 29). Диффузия через мембрану ионов хлора, содержание которых в межклеточной жидкости большинства тканей выше, чем в клетках, вызывает некоторое увеличение мембранного потенциала. Следовательно, для более точного вычисления потенциала покоя необходимо учитывать не только диффузию ионов калия, но и диф­фузию натрия и хлора. Уравнение (5) позволяет описывать мембранный потенциал только в первом приближении; для более точного определения потенциала при­ меняют обобщенное уравнение Гольдмана: *

(6)

где Р_к, Р_Na, Р_Cl — коэффициенты проницаемости мем­браны для ионов калия, натрия и хлора; [K], [Na], [Сl] — их активности внутри (i) и вне (е) клетки. Уравнение (6) позволяет определять мембранный по­тенциал не только в состоянии покоя, но и при возбуж­дении клетки. Для этого необходимо знание коэффи­циентов проницаемости для ионов. Если мембрана про­ницаема только для одного вида ионов, например для ионов калия, то Р_Na=Р_Cl=0 и уравнение (6) переходит в уравнение (5). По данным Ходжкина и Катца (1949),

₁₇₆

для аксона кальмара в состоянии покоя отношение коэф­фициентов проницаемости Р_K : P_Na : Р_Cl= 1 : 0,04 : 0,45.

Кроме простой диффузии ионов калия и натрия через мембрану, приводящей к определенным изменениям мем­бранной разности потенциалов, наблюдается обменная диффузия этих ионов. Поскольку при обменной диффу­зии потоки ионов через мембрану в прямом и обратном направлениях равны, электронейтральность растворов с обеих сторон мембраны сохраняется, т. е. наличие обмен­ной диффузии ионов не влияет на мембранный по­тенциал.

Имеются данные, что пассивный перенос калия че­рез мембрану сопряжен с пассивным переносом натрия по типу ионообменной диффузии. При этом калий ци­топлазмы заменяется на натрий внешнего раствора при сохранении постоянства мембранного потенциала.

ПОТЕНЦИАЛ ДЕЙСТВИЯ

Все клетки возбудимых тканей при действии различ­ных раздражителей достаточной силы способны перехо­дить в состояние возбуждения. К возбудимым отно­сятся нервная, мышечная и железистая ткани, хотя чет­кой границы между возбудимыми и другими тканями провести нельзя. Возбудимость — это способность клеток к быстрому ответу на раздражение, проявляющемуся через совокупность физических, физико-химических про­цессов и функциональных изменений. Обязательным признаком возбуждения является изменение электриче­ского состояния клеточной мембраны. Опыт показывает, что возбужденный участок клетки становится электроотицательным по отношению к невозбужденному, что указывает на перераспределение ионов в возбужденном участке. При возбуждении оно имеет временный характер, и после окончания возбуждения вновь восстанавли­вается исходный потенциал покоя. Общее изменение раз­ности потенциалов между клеткой и средой, происходящее при пороговом и сверхпороговом возбуждении клеток, называется потенциалом действия. Потенциалы

действия обеспечивают проведение возбуждения по нервны волокнам и инициируют процессы сокращения

мышечных и секреции железистых клеток. Ю. Бернштейн — автор мембранной теории — пола­гал, что при возбуждении мембрана становится хорошо

2 Медицинская биофизика 177

проницаемой для всех ионов. Ионные градиенты вслед­ствие этого исчезают и разность потенциалов на мембране уменьшается до нуля. Таким образом, согласно теории Бернштейна, потенциал действия не может быть больше потенциала покоя. Если измерить разность по тенциалов между возбужденным и невозбужденными

участками, то возбужденный участок будет электроотрицательным по отношению к невозбужденному, что и подтверждалось в опытах с отведением потенциалов от поверхности клеток.

Однако, когда применили методику внутриклеточного отведения потенциалов, то обнаружили, что при возбуж­дении мембранный потенциал не просто падает до нуля; он продолжает изменяться дальше и достигает значи-

тельной величины. На рис. 30, где показано изменение мембранного потенциала при возбуждении, видно, что в состоянии покоя внутренняя сторона клеточной оболочки имеет отрицательный потенциал, примерно равный — 45 мВ, тогда как при возбуждении мембранный потен­циал становится равным +40 мВ. Таким образом, пол­ное значение потенциала действия составляет 85 мВ, что значительно превышает величину потенциала покоя. Современная теория возникновения потенциала дей­ствия базируется на данных, полученных методами внутриклеточного отведения потенциалов, фиксации на-

₁₇₈

пряжения на мембране, радиоактивных изотопов, перфузии нервных волокон, электропроводности и др.

Еще в 1938 г. Коул и Кертис показали, что возбуждение связано с кратковременным увеличением электро­проводности клеточной мембраны. Согласно их данным, сопротивление мембраны аксона кальмара изменяется от 1000 Ом/см² в состоянии покоя до 25 Ом/см² в мо­мент возбуждения, а клетки водоросли Nitella от 100 000 до 500 Ом/см². При этом сопротивление цито­плазмы клеток практически не изменялось. Уменьшение электрического сопротивления мембраны при возбуж­дении может быть объяснено только увеличением ее проницаемости для ионов, поскольку последние явля­ются переносчиками электричества в тканях.

Дальнейшее развитие теории потенциала действия было связано с применением метода фиксации напря­жения на мембране (метод Ходжкина, Хаксли, Катца). Сущность этого метода заключается в том, что мембран­ный потенциал на участке мембраны смещают до неко­торой величины с помощью двух электродов, располо­женных на ее противоположных сторонах, и удержи­вают на этом уровне с помощью электронной схемы с отрицательной обратной связью. Ток, протекающий че­рез этот участок мембраны, служит мерой ее проницае­мости для ионов при данном напряжении и измеряется отдельным усилителем. Метод фиксации напряжения позволил раздельно изучить изменение проницаемости мембраны для ионов натрия и калия при возбуждении.

Было показано, что возникновение потенциала дейст­вия связано с увеличением проницаемости мембраны для ионов натрия и последующим усилением диффузии этих ионов по концентрационному градиенту внутрь клетки, что приводит к изменению (уменьшению) мембранного потенциала. При этом обнаружилось, что если мембран­ный потенциал уменьшается до некоторой критической величины (на 10 — 30 мВ), то, независимо от того, чем вызвано это уменьшение — наложением внешнего элек­трического поля или же действием другого раздражите­ли, между проницаемостью мембраны для натрия и уменьшением ее мембранного потенциала (деполяриза­цией) возникает регенеративная или положительная об­ратная связь. Уменьшение мембранного потенциала ниже критического уровня приводит к увеличению про-ницаемости мембраны для натрия, а увеличение про-

I

179

ницаемости сопровожда­ется усилением диффузии натрия в цитоплазму, что вызывает еще более зна­чительную деполяриза­цию мембраны (рис. 31). Благодаря наличию поло­жительной обратной свя­зи деполяризация мем­браны при возбуждении происходит с ускорением и поток ионов натрия в клетку все время возрас­ тает. Интенсивность же потока ионов калия, направленного из клетки наружу, в первые моменты возбуждения остается прежней. Уси­ленный поток положительно заряженных ионов натрия (внутрь клетки вызывает вначале исчезновение избыточ­ного отрицательного заряда на внутренней поверхности мембраны, а затем приводит к перезарядке мембраны. Поступление ионов натрия в клетку (Продолжается до тех пор, пока внутренняя поверхность мембраны не при­обретет положительный заряд, достаточный для уравно­вешивания градиента концентрации натрия и (прекра­щения его дальнейшего перехода внутрь клетки. Опи­санные процессы изменения проницаемости мембраны для ионов характерны для первой фазы потенциала действия — фазы деполяризации. По данным Ходжкина, отношение коэффициентов проницаемости мембраны аксона кальмара в это время Р_K : Р_Na : Р_Cl=1: 20 : 0,45. Если сравнить его с аналогичным соотношением в со­стоянии покоя Р_K : Р_Na : Р_Cl=1 : 0,04 : 0,45, то видно, что для калия и хлора в первой фазе возбуждения про­ницаемость не изменилась, а для натрия она увеличи­лась в 500 раз.

где Е_M — мембранный потенциал при возбуждении.

180

В еличину мембранного потенциала при возбуждении можно найти из уравнения (6). Так как Р_K и Р_Cl зна­чительно меньше Р_Na, то уравнение (6) переходит в уравнение Нернста для натриевого элемента:

Общее изменение мембранного потенциала при воз­буждении будет складываться из потенциала покоя и мембранного потенциала при возбуждении:

где Е — потенциал действия.

Благодаря этому амплитуда потенциала действия до­стигает 90 — 130 мВ (см. табл. 3) и, естественно, превы­шает величину потенциала покоя.

Натриевый механизм возникновения потенциала дей­ствия подтверждают опыты с изменением внешней и внутренней концентрации этих ионов. Было показано, что десятикратному изменению концентрации ионов нат­рия во внешней или внутренней среде клетки соответст­вует изменение потенциала действия на 58 мВ, что сле­дует и из уравнения (8). При этом выяснилось, что из­меняется именно та часть пика потенциала действия, которая превышала потенциал покоя, т.е. возникала за счет перезарядки мембраны при диффузии натрия в клетку. В этих опытах внутренняя концентрация ионов натрия изменялась при помощи микроинъекции солей натрия в клетки. При полном удалении ионов натрия из окружающей клетку жидкости потенциалы действия не возникали (если отсутствовали ионы лития и аммония — возможные заменители ионов натрия).

Таким образом, на основе обобщения большого экспериментального материала было установлено, что потенциалы действия возникают в результате избыточ­ной по сравнению с покоем диффузии ионов натрия из окружающей жидкости внутрь клетки.

Период, в течение которого проницаемость мембраны для ионов натрия при возбуждении клетки возрастает, является небольшим (0,5 — 1 мс); вслед за этим наблю­дается повышение проницаемости мембраны для ионов калия и, следовательно, усиление диффузии этих ионов из клетки наружу. Увеличение ионного потока калия, направленного из клетки наружу, приводит к уменьше­нию мембранного потенциала, что в свою очередь обус­ловливает уменьшение проницаемости мембраны для ионов натрия, которая, как указывалось, является функцией мембранного потенциала. Таким образом, вто­рой этап возбуждения характеризуется тем, что поток ионов калия из клетки наружу возрастает, а встречный

181

поток ионов натрия уменьшается. Это продолжается до тех пор, пока не произойдет восстановления потен­циала покоя — реполяризация мембраны. После этого проницаемость для ионов калия также падает до исход­ной величины. Наружная поверхность мембраны за счет вышедших в среду положительно заряженных ионов ка­лия опять приобретает положительный потенциал по отношению к внутренней. Эта фаза, в течение которой мембранный потенциал возвращается до уровня потен­циала покоя, называется фазой реполяризации. Она всегда продолжительнее фазы деполяризации и на кри­вой потенциала действия представлена в виде более по­логой нисходящей ветви. Таким образом, реполяризация мембраны происходит не в результате обратного пере­мещения ионов натрия, а вследствие выхода из клетки эквивалентного количества ионов калия.

В некоторых случаях проницаемость мембраны для ионов натрия и калия после окончания возбуждения остается повышенной. Это приводит к тому, что на кри­вой потенциала действия регистрируются так называе­мые следовые потенциалы, характеризующиеся малой амплитудой и сравнительно большой длительностью. Если скорость падения (проницаемости мембраны для натрия в фазе реполяризации замедляется, то возникает отрицательный следовой потенциал. Положительный следовой потенциал выражается в гиперполяризации (увеличении потенциала покоя) мембраны и обусловлен тем, что проницаемость мембраны для калия в восста­новительный период некоторое время остается повы­шенной.

Таким образом, формирование потенциала действия обусловлено двумя ионными потоками через мембрану: поток ионов натрия внутрь клетки приводит к переза­рядке мембраны, а противоположно направленный по­ток ионов калия обусловливает восстановление исходно­го потенциала покоя. Потоки приблизительно равны по величине, но сдвинуты во времени. Благодаря этому сдвигу во времени и возможно появление потенциала действия. Если бы потоки натрия и калия через мембра­ну совпадали во времени, то они бы компенсировали друг друга и никакого изменения мембранного потен­циала не могло бы происходить. На рис. 32 показаны кривые изменения потоков натрия и калия через мем­брану во время развития потенциала действия аксона

182

кальмара, полученные по данным метода фиксации на­пряжения. Ионные потоки выражались в единицах элек­трической проводимости.

Непосредственное измерение ионных потоков калия и натрия при возбуждении было произведено с помощью радиоактивных ⁴²К и ²⁴Nа. Так, Кейнесом (1951) было показано, что в гигантском нервном волокне каракатицы за каждый импульс в клетку поступает 3,7 пикомоль (1 пикомоль = 10^-12 моль) натрия на 1 см² поверхности волокна. Примерно такое же количество ионов калия за один импульс выходит из клетки. По данным Флойда, суммарный перенос натрия в клетку и калия из клетки за один импульс в аксонах кальмаров составляет вели­чины от 3 до 4,5 пикомоль/см² у разных видов.

Таким образом, при каждом акте возбуждения клет­ка приобретает определенное количество ионов натрия и теряет такое же количество ионов калия. А. Ходжкиным подсчитано, что концентрационные градиенты калия

₁₈₃

и натрия гигантского аксона кальмара за один нервный импульс уменьшаются на одну миллионную долю от исходной величины. Благодаря такому экономному ис­пользованию энергии градиентов клетки способны гене­рировать сотни тысяч импульсов без подзарядки своих концентрационных батарей, что и обусловливает высо­кую работоспособность и неутомляемость нерва. Но в конечном итоге диффузия натрия и калия по градиентам должна бы приводить к выравниванию концентраций этих ионов между наружным раствором и цитоплазмой. В действительности этого не наблюдается. В периоды покоя концентрационные градиенты калия и натрия вос­станавливаются в результате работы натрий-калиевого насоса, обеспечивающего перенос этих ионов против гра­диентов.

Благодаря регенеративным свойствам мембраны и тому, что величина потенциала действия определяется величиной ионных градиентов, при возбуждении клеток наблюдается ответ по типу «все или ничего». Если внеш­ний стимул способен деполяризовать мембрану до кри­тической величины, то возникает положительная обрат­ная связь — «деполяризация — проницаемость для нат­рия» и в дальнейшем потенциал действия генерируется автоматически за счет энергии ионных градиентов. Если величина ионных градиентов с течением времени не из­меняется, то и возникающие потенциалы действия будут иметь одинаковую амплитуду. При этом внешний сти­мул по отношению к энергии ионных градиентов играет лишь роль спускового механизма.

При действии подпороговых стимулов проницаемость мембраны для натрия возрастает незначительно и депо­ляризация не достигает критического значения. Деполя­ризация мембраны меньше критического уровня назы­вается местным потенциалом. Местные потенциалы не способны распространяться на значительные расстоя­ния, а затухают вблизи места своего возникновения. Эти потенциалы не подчиняются закону «все или ничего» — их амплитуда и длительность пропорциональны интен­сивности и длительности раздражения. При повторном действии подпороговых стимулов местные потенциалы мо­гут суммироваться, достигать критического значения и вызывать появление распространяющихся потенциалов действия. Таким образом, местные потенциалы могут предшествовать возникновению потенциалов действия.

₁₈₄

Особенно отчетливо это наблюдается в клетках прово­дящей системы сердца, где медленная диастолическая деполяризация, развивающаяся спонтанно, вызывает по­явление потенциалов действия.

Следует отметить, что натрий-калиевый механизм ге­нерирования потенциала действия является не единст­венным. В клетках водорослей Хара реверсия мембран­ного потенциала обусловлена диффузией в клетку ионов хлора. Обнаружены также клетки, у которых реверсия мембранного потенциала обусловлена диффузией ионов кальция. К таким, в частности, относятся волокна глад­ких мышц кишечника, матки, сосудов и других полых органов.