В клетку

Градиенты, по которым осуществляется перенос ве­ществ, являются энергетическим условием для переноса. Кроме энергетического фактора, важное значение для транспорта веществ имеет путь, по которому осущест­вляется проникновение веществ.

При всем многообразии строения и физико-химиче­ских свойств молекул проникающих веществ существует два пути их проникновения через клеточную мембрану: 1) проникновение за счет растворения проникающих веществ в липидах клеточной мембраны; 2) проникно­вение через поры клеточной мембраны, соединяющие ци­топлазму клеток с внешней средой. Первый способ про­никновения присущ водонерастворимым органическим соединениям, а второй характерен для молекул водора­створимых веществ и ионов.

Зависимость проникающей способности веществ от их растворимости в липидах впервые установил Овер- тон в 1895 — 1899 гг. Он сформулировал два эмпирических правила:

1. проницаемость клеток для органических молекул уменьшается по мере возрастания в молекулах количе­ства гидроксильных, карбоксильных и аминных групп. Чем больше молекулы вещества содержат групп –СООН, -NH₂ и -ОН, тем хуже это вещество проникает в клетку;

2. проницаемость клеток для органических молекул возрастает по мере увеличения в молекулах количества метиловых, этиловых и фенильных групп.

Впоследствии Джекобс (1924), исходя из теории электрического строения молекул, дал объяснение пра­вилам Овертона. Он показал, что все химические соеди­нения, а также отдельные, входящие в их состав ради­калы, делятся на две большие группы: полярные и неполярные соединения.

Неполярные молекулы электрически симметричны — их центры положительных и отрицательных зарядов сов-

151

падают. Метиловые, этиловые и фенильные группы яв­ляются неполярными. Неполярные соединения имеют низкую диэлектрическую проницаемость и не растворя­ются в полярных растворителях (воде, спиртах), по­скольку растворение в полярном растворителе в основ­ном обусловлено взаимодействием полярных групп ве­щества с полярными молекулами растворителя. Зато неполярные вещества (вернее, малополярные) хорошо растворяются в неполярных растворителях (липидах, хлороформе, ацетоне), так как им легко разрушить структуру неполярного растворителя. При этом раство­римость вещества будет тем выше, чем менее полярны его молекулы. При увеличении количества неполярных групп полярность всей молекулы в целом уменьша­ется — эти группы как бы маскируют полярность, имеющуюся у отдельных частей молекулы. Соответст­венно повышается их растворимость в липидах и облег­чается их диффузия через клеточную мембрану.

Гидроксильные, карбоксильные и аминные группы относятся к полярным соединениям — центры их поло­жительных и отрицательных зарядов не совпадают из-за полярности и несимметричности химических связей меж­ду атомами. Полярные соединения имеют высокую ди­электрическую проницаемость, хорошо растворяются в воде и других полярных растворителях и плохо раст­воряются в неполярных растворителях. При увеличении в молекулах органических веществ количества полярных групп их растворимость в липидах понижается, что при­водит к уменьшению проницаемости клеток для этих соединений.

К веществам, проникающим в клетку путем растворе­ния в липидах клеточной мембраны, относятся липиды, органические жирные кислоты, различные эфиры и дру­гие малополярные органические соединения. Для ве­ществ, проникающих в клетку путем растворения в ли­пидах клеточной мембраны, размер молекул не имеет существенного значения. Более крупные, но менее поляр­ные молекулы будут проникать лучше, чем более поляр­ные, имеющие меньший размер. При этом, вероятно, белковые молекулы, образующие сплетения на поверх­ности липидных слоев в мембране, не служат препятст­вием для проникающих молекул.

Второй путь проникновения веществ в клетку — че­рез поры клеточной мембраны — открыт для молекул

₁₅₂

водорастворимых веществ. К таким веществам отно­сятся минеральные кислоты, соли и основания, а также органические вещества, молекулы которых содержат полярные группы: сахара, аминокислоты, спирты, моче­вина и другие полярные органические соединения.

Так как поры в мембранах имеют ограниченные раз­меры, то через них могут проникать молекулы и ионы только в том случае, если их диаметр не превышает диаметра пор (0,35—0,8 нм). Между размером молекул и их диффузионной способностью через мембрану суще­ствует обратное отношение. Товертом было показано, что коэффициент диффузии D молекул, диаметр кото­рых не превышает диаметра гексоз, обратно пропорцио­нален квадратному корню их молекулярной массы М:

(6)

Таким образом, клеточная мембрана для неполярных соединений служит растворителем для полярных — молекулярным ситом.

Максимальной проникающей способностью через мембрану обладают вода и растворенные в ней газы, например кислород и азот; на другом конце шкалы про­ницаемости находятся ионы. Коэффициент проницаемо­сти мембраны для воды составляет 10^-4 см/с, что в 10 000 раз меньше скорости диффузии молекул воды через водный слой толщиной 7,5 нм. На основе этого заключили, что площадь пор составляет очень малый процент от площади всей мембраны. Расчеты Соломона показали, что диаметр пор в мембране эритроцитов ра­вен 0,7 — 0,85 нм и что они занимают только 0,06% всей поверхности эритроцита. Это говорит о том, как сильно изолирована клетка от окружающей среды. Например, мочевина, которая считается относительно легко проникающим веществом, поступает в клетку в 10⁵ раз мед­леннее воды, а некоторые ионы проникают сквозь кле­точную мембрану в 10⁵ раз медленнее мочевины.

Проницаемость клеточной мембраны для катионов и анионов различна; как правило, клетки более проницае­мы для катионов. Исключение представляют эритроци­ты — анионы проникают в них почти в миллион раз бы­стрее, чем катионы.

Для того чтобы молекула или ион водорастворимого вещества могли проникнуть через мембрану, они долж-

153

ны обладать определенным запасом кинетической энер­гии, аналогичным энергии активизации при вступлении в химическую реакцию. Эта энергия расходуется на преодоление ряда энергетических барьеров. Так, моле­куле или иону, для того чтобы войти в пору, необходи­мо оторваться от окружающей их гидратной оболочки; при прохождении через пору необходимо преодолеть электрическое взаимодействие своих полярных групп с заряженными полярными группами стенки поры, пред­ставляющими собой фиксированные заряды в порах. Это главные барьеры.

Предполагают, что основное значение в возникнове­нии фиксированных зарядов в порах и на мембране имеют диссоциирующие полярные группы белков: кар­боксильные и аминные. При диссоциации карбоксильной группы возникает отрицательный фиксированный заряд, а при диссоциации аминной группы — положительный. Знак заряда поры и мембраны будут определяться соот­ношением числа положительных и отрицательных заря­дов. Заряд пор может быть обусловлен не только на­личием полярных ионогенных групп в мембране, но и адсорбцией ионов из раствора поверхностью мембраны и стенками пор. Впервые на значение фиксированных зарядов в мембране в процессе проникновения веществ через нее было указано Михаэлисом в 1933 г.

Особенно большой барьер существует для про­никновения через мембрану ионов. Это обусловлено значительным электрическим взаимодействием ионов с заряженными группами пор. Если частица при­ближается к одноименно заряженной поре, то при этом она испытывает отталкивание и про­никает через мембрану только в том случае, если обладает кинетической энергией, достаточной для прео­доления этого отталкивания. Если частица и поверх­ность поры заряжены противоположно, то частица испы­тывает притяжение к центру поры и ее проникновение во многих случаях может облегчаться. Но так как ион притягивается к электрическому центру поры, то в не­которых случаях он может оказаться в потенциальной яме, как бы фиксируясь в центре поры и препятствуя поступлению остальных ионов.

Если плотность фиксированных зарядов одного знака в мембране достигает большой величины, то такая мембрана обладает избирательной проницаемостью по

154

отношению к катионам и анионам. Она хорошо пропус­кает ионы, знак заряда которых противоположен знаку фиксированных в мембране зарядов, и плохо пропускает одноименно заряженные ионы. В настоящее время ис­кусственно получают мембраны, называемые ионооб­менными, которые обладают очень высокой степенью избирательности. Такие мембраны пропускают ионы одного знака и практически не пропускают ионы другого знака.

И. Тасаки, исследуя изотопным методом диффузию различных ионов через мембрану аксона в состоянии покоя, установил, что скорость диффузии одновалент­ных катионов превышает приблизительно в 10 раз ско­рость диффузии анионов при равных условиях. Это дает основание предполагать, что в мембране аксона сущест­вует слой с относительно высокой концентрацией фикси­рованных отрицательных зарядов. Этот слой уменьшает потоки анионов и придает мембране катионообменные свойства. Это подтверждают и данные, полученные при изучении электрохимических свойств клеточных поверх­ностей методом электрофореза и электроосмоса. Со­гласно этим данным, все биологические поверхности в норме имеют отрицательный электрический заряд, обус­ловленный или диссоциацией ионогенных групп, или ад­сорбцией ионов (см. главу 8).

Ионы водорода и гидроксила, несмотря на свой отно­сительно малый ионный радиус, практически не прони­кают в клетку. Это обусловлено высокой химической ак­тивностью данных ионов, благодаря которой они захва­тываются концевыми химическими группами поверхно­сти мембраны еще до поступления внутрь последней. В результате этого поверхностные группы приобретают соответствующий заряд, который препятствует прибли­жению к мембране других ионов, заряженных одно­именно.

Сказанным объясняется тот факт, что сильные кис­лоты и сильные основания, дающие при диссоциации ноны водорода и гидроксила, вообще не проникают в нормальную неповрежденную клетку. Эти вещества мо­гут проникнуть в клетку только в том случае, если ее мембрана предварительно повреждена в результате действия или самих сильных кислот и оснований, или других повреждающих факторов. Так, в известных опы­тах С.С.Чахотина помещение яиц морского ежа, в ко-

₁₅₅

торые предварительно был введен индикатор — ней­тральный красный, в слабый раствор серной кислоты не приводило к изменению окраски яиц. Но если на клетку направляли тонкий пучок ультрафиолетовых лучей, то в месте лучевого «микроукола» возникало резкое измене­ние окраски, свидетельствующее о проникновении кисло­ты в месте повреждения.

В отличие от сильных кислот и оснований слабые кислоты и основания легко проникают в клетки. Они имеют низкую степень диссоциации и в недиссоциированном виде сравнительно хорошо растворяются в липидах, что и служит причиной их способности проникать через мембраны. Если слабые кислоты и основания на­ходятся в диссоциированном виде, то они не могут про­никать через мембраны по той же причине, по которой не могут проникать сильные кислоты и основания. Из сказанного следует, что проницаемость для слабых кис­лот и оснований зависит от рН среды. Изменение рН среды, вызывающее уменьшение степени диссоциации этих соединений, будет приводить к повышению прони­цаемости клеток для них. И наоборот, изменение этого фактора, вызывающее увеличение степени диссоциации, приведет к понижению проницаемости клеток для рас­сматриваемых соединений.

Так, Овертон еще в 1897 г. показал, что если помес­тить головастиков в воду, в которую добавлен азотно­кислый стрихнин (до концентрации 0,01%), то гибели животных не происходит. Однако если к этому раствору добавить небольшое количество соды, что для голова­стиков само по себе совершенно безвредно, то живот­ные быстро погибают. Причина этого эффекта ясна: в отсутствие соды стрихнин находился в диссоциирован­ной форме — в виде катиона; после добавления соды он образует с гидроксилом, возникающим при гидролизе соды, слабодиссоциирующее основание, которое легко диффундирует через покровные ткани животного и вы­зывает его гибель.

Следует отметить, что причиной повышения или по­нижения проницаемости мембран при изменении рН среды может служить не только уменьшение и увеличе­ние степени диссоциации проникающего вещества, но и изменение степени диссоциации ионогенных групп по­верхности мембраны и пор, которые обусловливают воз­никновение фиксированных зарядов в мембране.

156

Если рН клетки и среды имеют разные значения, то молекулы слабых электролитов после их поступления в клетку могут диссоциировать на ионы. Последние, обладая зарядом, уже с трудом выходят наружу, оказываясь как бы попавшими в ловушку. Таким образом, различие в рН между содержимым клетки и внешней средой мо­жет обусловливать явление односторонней проницаемо­сти слабых электролитов и их накопление в клетке.

Согласно Д. Л. Рубинштейну (теория мембранных градиентов), в основе любого процесса односторонней проницаемости лежит различие в численном значении физико-химических параметров среды и клетки. При этом односторонняя проницаемость может приводить к накоплению определенных веществ в клетке в концент­рациях более высоких, чем в среде. Для пассивного на­копления вещества достаточно, чтобы молекулярное со­стояние проникающего вещества подвергалось в клетке какому-либо изменению. Оно может в клетке диссоциировать, окисляться или восстанавливаться, аминироваться или ацетилироваться и т. д. Если в результате любого из этих превращений получается вещество, хуже проникающее через клеточную мембрану, оно будет на­капливаться в клетке. Накопление является результатом перехода проникающего вещества в другое молекуляр­ное состояние, для которого клеточная мембрана менее проницаема. Напротив, если внутриклеточные реакции переводят вещество в форму, лучше проникающую через мембрану, то его концентрация в клетке может поддер­живаться на пониженном уровне. Следует иметь в виду, что во всех случаях перенос вещества осуществляется по градиенту, который поддерживается на постоянном уровне, поскольку вещество после проникновения через мембрану переходит в другую форму. Так как градиен­ты поддерживаются на постоянном уровне за счет энер­гии клеточного метаболизма, обеспечивающего различие и значении физико-химических параметров среды и клет­ки, то в конечном счете накопление вещества уже яв­ляется активным процессом.

АКТИВНЫЙ ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ В КЛЕТКАХ

Выше были рассмотрены основные виды пассивного транспорта веществ в клетках. Как указывалось, при массивном транспорте энергия метаболических процес-

157

сов не расходуется, а перенос веществ в клетках осуществляется по электрохимическому градиенту. Вследствие этого градиенты клетки имеют тенденцию к уменьшению — пассивный перенос всегда стремится выровнять неравномерность в распределении веществ между клеткой и средой. Но, как показывает опыт, клеточное со­держимое резко отличается по своему составу от окру­жающей клетку среды. В клетке содержатся в боль­ших количествах ионы калия, недиффундирующие ионы белков, фосфолипидов, анионы аминокислот и другие ионы органических веществ, содержание которых в жид­кости, окружающей клетку, незначительно. Другие веще­ства, напротив, в значительно более высоких концентра­циях содержатся в окружающей жидкости, чем в клетке, например ионы натрия. Такое неравномерное распреде­ление веществ между клеткой и средой не может быть полностью объяснено наличием только пассивного транс­порта веществ, который, как указывалось, всегда приво­дит к уменьшению электрохимических градиентов.

Вышеприведенные данные, а также ряд других, по­зволяют сделать заключение, что в клетках наряду с пассивным происходит и активный транспорт веществ. Перенос молекул и ионов против электрохимического градиента, осуществляемый клеткой за счет энтропии метаболических процессов, называется активным транспортом.

Осуществляя перенос веществ против градиента, клетка совершает определенную работу, которая назы­вается концентрационной или осмотической. Эта работа состоит, с одной стороны, в накоплении клеткой веществ,

присутствующих в окружающей среде в малых количествах, а с другой — в выведении в окружающую среду веществ, которые в самой этой среде присутствуют в высоких концентрациях.

В еличина концентрационной работы при переносе незаряженных частиц только против сил диффузии (про­тив концентрационного градиента) может быть найдена из уравнения: (7)

где А — работа; т — количество молей вещества, перенесенного через мембрану из области с активной кон-

₁₅₈

центацией вещества С₂ в область с концентрацией С₁ R — газовая постоянная; Т — абсолютная температура. Если происходит перенос ионов через электрически поляризованную мембрану, то работа совершается не только против сил диффузии, но и против сил электри­ческого поля мембраны. В этом случае общая работа А может быть найдена из уравнения:

(8)

где m — количество перенесенных грамм-ионов веще­ства; п — валентность ионов; F = 96 500 Кл — число Фарадея — заряд 1 г-экв ионов; Е₁—Е₂ — разность потен­циалов между поверхностями мембраны; С₁и С₂ — ак­тивные концентрации ионов по одну и по другую сто­роны мембраны. Знаки плюс и минус в уравнении (8) показывают, что в зависимости от знака заряда ионов электрический градиент мембраны может иметь направление, либо совпадающее с направлением концентра­ционного градиента (плюс), либо противоположное ему (минус). Соответственно и работа по переносу ионов в электрохимическом градиенте равна либо сумме работ по переносу в концентрационном и электрическом гра­диентах, либо их разности.

Большинство гипотез механизма активного переноса базируется на предположении о существовании специальных переносчиков, захватывающих переносимое

сквозь мембрану вещество и доставляющих его на другую сторону клеточной мембраны. Возможно, что этот переносчик пространственно ориентирован внутри мембраны в направлении, перпендикулярном ее поверхности, что дает ему возможность образовывать комплекс с пе­реносимой молекулой и в то же время ориентировать её проникновение в клетку.

Исходя из данных, имеющихся к настоящему време­ни, активный транспорт веществ разделяют на два вида: активный перенос ионов и активный перенос органиче­ских веществ, главным образом Сахаров и аминокислот. По-видимому, к активному транспорту следует отнести и такое явление, как пиноцитоз — «питье клеток», когда вещества поступают в клетку «упакованными» в клеточ­ную мембрану.

Явление активного переноса ионов к настоящему вре­мени обнаружено у большого количества клеток и тка-

159

ней. Интересный пример активного переноса представ­ляет кожа лягушки. Крогом было обнаружено, что эта ткань специализируется на переносе ионов натрия из ок­ружающей среды в интерстициальную жидкость, где их концентрация в 10 000 раз выше, чем в среде. Именно такой механизм лежит в основе снабжения тканей ля­гушки этими необходимыми для ее жизнедеятельности ионами. Впоследствии Уссингом с сотрудниками был разработан метод изучения активного транспорта натрия через кожу лягушки. Если разделить две камеры, содер­жащие нормальный раствор Рингера, свежеизолирован­ной кожей лягушки, то внутренняя поверхность кожи заряжается положительно по отношению к наружной. Разность потенциалов при этом достигает 100 мВ. Это так называемая «насосная» разность потенциалов, воз­никновение которой обусловлено активным переносом натрия. Подавая от внешнего источника ЭДС напряже­ние противоположного направления, можно скомпенси­ровать разность потенциалов через кожу. В этих усло­виях перенос ионов через кожу под влиянием электри­ческого поля невозможен, так же как и путем диффузии, так как растворы по обе стороны кожи идентичны. Однако продолжает иметь место перенос ионов натрия от наружной поверхности к внутренней, в чем можно убедиться, используя меченный натрий. О том, что имеет место однонаправленный перенос ионов натрия, можно судить и по наличию тока в компенсационной цепи. По­скольку разность потенциалов скомпенсирована, то ток в компенсационной цепи численно равен току, возни­кающему благодаря одностороннему переносу через кожу положительных зарядов, т. е. ионов натрия.

Перенос натрия через кожу лягушки непосредственно связан с обменом веществ. Многочисленные ингибиторы окислительных процессов приводят немедленно к сниже­нию или прекращению переноса ионов натрия и к ис­чезновению разности потенциалов через кожу. Анало­гичные явления наблюдались и в опытах с другими сложными мембранными системами.

Перенос ионов отчетливо выражен в различных се­креторных клетках — в слюнных и потовых железах и особенно в железах желудка, выделяющих большие ко­личества ионов водорода и хлора.

О высокой интенсивности процессов активного пере­носа ионов в клетках свидетельствуют данные термоди-

160

намических расчетов. Высчитано, что 10% энергии метаболизма мышцы лягушки в покое расходуется на пере­нос ионов натрия. Этот показатель возрастает до 50% в определенных условиях опыта, стимулирующих (перенос ионов.

Большое количество работ посвящено исследованию активного переноса ионов калия и натрия через клеточ­ные мембраны. Это объясняется их большой ролью в та­ких важных явлениях, как генерирование биоэлектриче­ских потенциалов и проведение возбуждения.

Как указывалось, ионы калия и натрия неравномер­но распределены между цитоплазмой клеток и межкле­точной жидкостью. В то же время данные, полученные с помощью изотопных методов, показали, что эти ионы могут диффундировать через мембраны. С помощью этих же методов было установлено, что при каждом акте возбуждения клетки приобретают определенное количе­ство ионов натрия и теряют эквивалентное количество ионов калия. В свете этих данных становится ясным, что поддержание электрохимических градиентов калия и натрия неизменными на протяжении всей жизни клеток возможно только в том случае, если эти ионы перено­сятся специальными механизмами против градиентов. Этот перенос будет компенсировать уменьшение гра­диентов, вызванное диффузией. И действительно, непо­средственные измерения с помощью радиоактивных ⁴²K и ²⁴Na показали, что большинство изученных клеток на­ходятся в стационарном состоянии. При этом скорость поступления данного иона внутрь клетки равна скорости потока ионов того же вида из клетки во внешнюю среду.

Кроме того, было установлено, что при выключении гликолиза и окислительного фосфорилирования ингиби­торами метаболических процессов (йод уксусная кислота, цианиды, динитрофенол и др.) неравномерность в рас­пределении ионов уменьшается вплоть до полного вы­равнивания их концентраций в клетке и во внешней сре­де. Если же путем микроинъекции в отравленное нерв­ное волокно кальмара ввести некоторое количество ЛТФ, то перенос ионов против градиентов возобнов­ляется. Неравномерность в распределении ионов умень­шается также при охлаждении клеток, приводящем к замедлению метаболических процессов. Так, при охлаж­дении эритроцитов человека до 2°С они начинают выделять ионы калия и поглощать ионы натрия до тех пор,