Глава 6 проницаемость живых клеток

Являясь открытой термодинамической системой, клетка постоянно осуществляет обмен веществом с окружающей средой. Такой обмен возможен благодаря спо­собности клеток пропускать различные вещества через свою оболочку. Эта способность клеток называется проницаемостью.

136

Проблема клеточной проницаемости включает в себя исследование кинетики поступления (транспорта) ве­ществ в клетку и из клетки и механизма распределения веществ между клеткой и средой в стационарных усло­виях. Изучение проницаемости клеток имеет огромное теоретическое и практическое значение. Вся жизнедеятельность клеток связана с проницаемостью: метаболи­ческие процессы, распределение вещества между клет­кой и тканевой жидкостью, генерирование биопотенциалов.

Изучение проницаемости имеет большое значение для медицины, особенно для фармакологии и токсикологии. Для эффективного использования фармакологических средств необходимо знать их проникающую способность в различные клетки в норме и при патологии.

Методы изучения проницаемости

В настоящее время для исследования и оценки проницаемости клеток применяют следующие основные ме­тоды: остмотические, индикаторные, химические, радиоактивных изотопов, измерения электропроводности.

Осмотические методы основаны на наблюдении за кинетикой изменения объема клеток при помещении их в гипертонические растворы разной концентрации. Когда клетки помещают в гипертонический раствор исследуемого вещества, то вследствие выхода из них воды объем их уменьшается. По мере поступления исследуе­мого вещества в клетку разность осмотического давле­ния между клеткой и средой уменьшается и клетка вос­станавливает свой первоначальный объем. Наблюдая за скоростью восстановления объема клеток, можно судить о скорости проникновения в них вещества. С целью объ­ективной регистрации этих процессов применяют центрифугирование взвеси клеток и визуальное определение их суммарного объема с помощью гематокрита, опреде­ление изменений светопропускания методом фотометрии, а также определение изменений показателя преломле­ния клеток и суспензионной жидкости.

Недостатком данного метода является то, что он применим только для работы с отдельными и довольно крупными клетками (водорослями, эритроцитами). Кроме того, этот метод неприменим при исследовании проницаемости для Сахаров и аминокислот, так как при

137

больших концентрациях этих веществ клетка для них непроницаема, а при малых концентрациях трудно уловить изменения объема клеток.

Индикаторные методы основаны на изменении окраски клеточного содержимого при поступлении в клетку

определенных веществ. В клетку вначале вводят индикатор, а затем помещают ее в раствор исследуемого ве­щества. При поступлении в клетку этих веществ наблюдается окрашивание. Если исследуемое вещество само является красителем, то необходимость в предваритель­ном введении индикатора отпадает. К недостаткам дан­ного метода следует отнести то, что небольшие концент­рации красителей трудно обнаружить, а большие кон­центрации токсичны, а также то, что этот метод дает в основном лишь качественный ответ проникает вещество в клетку или не проникает.

Химические методы основаны на обычном качественном и количественном определении содержания веществ в клетках или в среде, Клетки помещают в раствор исследуемого вещества и через определенные промежут­ки времени определяют концентрацию этого вещества в клетках или в растворе. Метод дает особенно хорошие результаты при работе с крупными клетками.

Методы радиоактивных изотопов основаны на применении изотопов, обладающих радиоактивностью. При этом исследуемое вещество метят с помощью какого-либо изотопа, т. е. включают в состав молекулы исследуемого вещества радиоактивный (меченый) атом. Если исследуемое вещество находится в виде атомов или ионов, то просто заменяют их радиоактивными изото­пами. После поступления этого вещества в клетку она становится радиоактивной, что можно зарегистрировать с помощью счетчика радиоактивных частиц. Поскольку радиоактивность клетки пропорциональна количеству поступившего в нее вещества, этот метод дает количественные, результаты. При измерении потока вещества из клеток в среду предварительно вводят вещество, ме­ченное по какому-либо атому, в клетки. Это производят или путем микроинъекции, или путем выращивания культуры клеток в среде, содержащей данное радиоак­тивное вещество. В последующем измеряют выходящие из клеток потоки данного вещества.

Изотопный метод является наиболее совершенным и точным методом исследования клеточной проницаемо-

138

сти. Пользуясь им, можно вводить в клетку исследуемое вещество в низких концентрациях, не нарушающих жизнедеятельность клеток. Применение изотопов позволило изучить проницаемость не только для молекул чужерод­ных или ядовитых веществ, но и для тех соединений, которые входят в состав клеток и тканевых жидкостей самого организма. С помощью изотопного метода удает­ся отдифференцировать потоки вещества из среды в клетку и из клетки в среду. Особая ценность метода заключается в том, что он удобен для изучения кинети­ки входа и выхода веществ и позволяет исследовать эти процессы в естественных условиях, когда клетка находится в стационарном состоянии.

Метод измерения электропроводности применяется при исследовании проницаемости клеток для ионов. Электропроводность клеток определяется активностью ионов в клетках и проницаемостью клеточных мембран (см. главу 9). При определенных условиях, например при измерении на низких частотах переменного тока, электропроводность является мерой проницаемости мембран.

ПАССИВНЫЙ ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ

Перемещение веществ в клетку или из нее в окружающую среду может осуществляться многими способами. В зависимости от того, чем представлен источник энергии для переноса веществ, что является движущей силой перемещения, все виды переноса веществ можно разделить на пассивный и активный транспорт. Пассивный транспорт веществ всегда осуществляется за счет энергии, сконцентрированной в каком-либо — градиенте, и энергия метаболических процессов клеток (энергия гидролиза АТФ) непосредственно на этот перенос не расходуется. Пассивный транспорт всегда проходит по направлению градиентов, т.е. от более высокого энергетического уровня к более низкому. В результате этого градиенты уменьшаются, если нет других процессов, обеспечивающих их поддержание на постоян­ном уровне. Часто в клетках одновременно имеется не­сколько градиентов, которые накладываются друг на друга, — суперпозиция градиентов. В таком случае пере-

139

нос вещества будет определяться результирующей всех градиентов. Если градиенты имеют одинаковое направление, то результирующий перенос будет равен сумме потоков вещества по отдельным градиентам. В случае двух противоположных по направлению градиентов результирующий перенос вещества будет равен разно­сти потоков по отдельным градиентам и иметь направ­ление, совпадающее с направлением того градиента, абсолютная величина которого больше. Понятно, что при наличии двух равных по абсолютной величине, но про­тивоположных по направлению градиентов результи­рующий перенос вещества будет равен нулю.

Основными градиентами, присущими живым организмам, являются концентрационные, осмотические, электрические и градиенты гидростатического давления жидкости.

В соответствии с этими градиентами имеются следующие виды пассивного транспорта веществ в клет­ках и тканях: диффузия, осмос, электроосмос и ано­мальный осмос, фильтрация.