Часть вторая биофизика клетки

Глава 5 ультраструктура клетки и биологических мембран

Вся сложность изучения процессов жизнедеятельно­сти организмов обусловлена не только сложными термодинамическими и кинетическими параметрами, отражаю­щими функциональные свойства живой материи, но и вы­сокой структурностью живого организма. Структурной и функциональной единицей живого организма является клетка, которой присущи все основные жизненные функ­ции. Клетка представляет собой открытую систему, ко­торая обменивается с окружающей средой веществом, энергией и информацией. Свободная энергия питатель­ных веществ расходуется в клетке на совершение раз­личного вида работ, на выполнение самых разнообразных функций. Регулирование всех функций клетки осу­ществляется на основе наследственной информации и информации, поступающей в клетку извне.

Все многообразные функции клетки тесно связаны с ее структурой. По существу, изучение ультраструктуры (тонкой структуры) клетки относится к функциональной морфологии: наблюдение структуры позволяет непосредственно понять функцию. Как отмечает В. Холличер, функция — это быстрое изменение структуры, а структу­ра — это квазистатическая (медленно изменяющаяся,, застывшая) функция.

Методы исследования

Ультратонкие структуры клетки наиболее подробно были изучены в последние 15 лет благодаря развитию и применению новых методов исследования структуры в

118

сочетании со старыми методами гистохимии и био­химии.

Изучение клеточных структур началось с применения оптического микроскопа. Принцип его работы основан на явлении преломления света и на формировании изображения с помощью оптической системы линз. Разрешаю­щая способность микроскопа зависит от длины волны λ света и численной апертуры А линз объектива. Пре­дел разрешения (т. е. минимальное расстояние между двумя точками, при котором они видны еще раздель­но, — величина, обратная разрешающей способности) определяется по формуле Аббе:

Длина волны света лимитирует предел разрешающей способности микроскопа. Учитывая, что максимальное значение А не превышает 1,4, можно вычислить, что при использовании белого света (λ=550нм) предел разре­шения будет равен 250 нм. Если использовать фиолето­вые лучи (λ = 400 нм), то предел разрешения будет равен 170 нм, а при использовании ультрафиолетовых лу­чей (λ = 200—300 нм) — 100 нм, что является пределом светового микроскопа. Для наблюдения ультраструктур клетки, имеющих размеры на порядок меньше, этого явно недостаточно.

У обычного светового микроскопа есть еще один недостаток: он дает недостаточно контрастное изображение. Чтобы получить контрастное изображение приме­няют методы фазово-контрастной и интерференционной микроскопии, позволяющие изучать структуру нефиксированных клеток.

Возможность непосредственного изучения биологических ультраструктур появилась после изобретения электронного микроскопа. Его разрешающая способность значительно выше, чем у светового микроскопа. Предел разрешения современных электронных микроскопов со­ставляет 0,5—1 нм, а увеличение — сотни тысяч раз. Ход лучей в световом и электронном микроскопах в принципе одинаков. Но роль пучка света в электронном микроскопе выполняет поток электронов, а роль линз — электростатическое или электромагнитное поле. Цен­ность метода электронной микроскопии несколько сни­жается из-за того, что препараты для исследования не-

₁₁₉

обходимо высушивать, фиксировать и контрастировать солями тяжелых металлов.

Очень большое значение в изучении структур клетки и макромолекул имеет метод рентгеноструктурного анализа (дифракции рентгеновских лучей). Метод основан на явлении дифракции. Дифракция наблюдается в тех случаях, когда на пути лучей имеются препятствия, сравнимые по размерам с длиной волны лучей. Метод рентгеноструктурного анализа заключается в том, что на исследуемый объект направляют параллельный пучок рентгеновых лучей. За объектом помещают фотопленку, на которой регистрируется получающаяся дифракцион­ная картина. На рентгенограмме можно увидеть множе­ство пятен (дифракционных максимумов), образующих­ся в результате интерференции дифрагированных лучей. Из анализа рентгенограммы получают данные о струк­туре объекта на молекулярном и даже атомном уров­нях. Вначале описанный метод был применен для изуче­ния структуры кристаллов, а затем и для исследования других периодических структур. Этот метод является од­ним из самых мощных методов, применяемых в области молекулярной биологии и при изучении ультраструктур. Его ценность состоит в том что он дает возможность не только определять пространственное расположение молекул, но и точно измерять расстояние между ними

и даже выявлять их внутримолекулярную организацию. Особое достоинство метода, обусловливающее его преимущество по сравнению с электронной микроскопией, заключается в том, что он позволяет анализировать структуру нефиксированных препаратов.

В последнее время большое значение приобрели методы разделения клеток на отдельные фракции. Большинство методов фракционирования основано на гомо­генизации ткани (получении однородной клеточной мас­сы) или механическом разрушении клеток различными способами с последующим разделением субклеточных фракций по их относительной плотности, массе и т.д. на препаративных и аналитических центрифугах. Эти методы применяются в совокупности с электронным микроскопированием и рентгеноструктурным анализом.

При исследовании химического состава клеток применяются различные методы ультрахимии. Эти методы основаны на получении вещества из клетки в очень не­больших количествах. С помощью микропипеток, а так-

120

же другими способами получают содержимое клетки, её отдельных частей и органоидов. В последующем производят качественный и количественный анализ получен­ных веществ специальными химическими методами. К этой же группе методов относятся и методы разбор­ки мембран на составные компоненты путем экстраги­рования белков или липидов.