Методы кристаллизации

Было разработано несколько методов для выращивания белковых кристаллов путем помещения белка в среду (раствор), пригодную для такого процесса.

Диффузия паров

Многие кристаллографы предпочитают метод диффузии паров (Рис. Е3.3). Он относительно несложный, а главное – полученные в результате кристаллы легко собрать для дальнейшего рентгенографического исследования.

Капля, содержащая белок, уравновешивается относительно большого резервуара раствора (маточный раствор). Летучие соединения, такие как вода, определенные ионы и небольшое количество растворенных веществ, диффундируют между двумя растворами, пока не будет достигнуто равновесие, т.е. давление пара в капле сравняется с давлением в резервуаре. Остается надеяться, что условия в капле будут способствовать кристаллизации белка. По мере того, как капля приходит в равновесие, концентрация белка в ней, как правило, увеличивается и, в оптимальном случае, доходит до фазы кристаллизации. Объем капли обычно составляет от 100 нл до 2 мкл.

Рис. Е3.3. Кристаллизация в висячей капле методом диффузии паров

Диффузия пара.

При диффузии пара размер капель, как правило, уменьшается в ходе установления равновесия, увеличивая концентрации компонентов. Хотя белки, как правило, кристаллизуются при концентрировании, для некоторых белков растворимость уменьшается, когда их раствор разбавляется водой (обратная диффузия). В таких случаях резервуар изначально больше разжижен, чем капля, которая растет в размере по мере установления равновесия. В каждом случае за счет изменения условий внутри капли белок либо кристаллизуется, либо выпадает в осадок.

Диализ

Кристаллы можно получить еще и путем диализа белкового раствора в растворе для кристаллизации. При таком подходе поддерживается приблизительно постоянная концентрация белка.

Затравка

Когда белковые кристаллы слишком малы для рентгеновской кристаллографии, затравка дает возможность увеличить размер кристалла. При этом берут кристалл и добавляют его в новую каплю, содержащую белок. После этого кристалл выполняет роль зародыша, из которого может вырасти более крупный кристалл. Для микрокристаллов ее легко осуществить с помощью усика, который прикасается к ним, а затем удаляется через новую каплю. Более крупные кристаллы часто "протравливаются" при прохождении через воду перед тем, как добавить их в новую каплю. Интересно, что кристаллы из одного белка иногда помогают инициировать рост кристалла из другого, но похожего белка.

Инициация кристаллизации.

Белковые молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) связывают и демонстрируют определенные пептиды для иммунной системы. Молекула ГКГС, демонстрирующая один тип пептидов, использовалась для выращивания кристаллов такой же молекулы ГКГС, представляющей другой пептид (Bjorkman at al., 1987).

Мембранные белки

Посредством рентгеновской кристаллографии определено очень небольшое число структур мембранных белков. Дело в том, что поскольку эти белки заключены в клеточные липидные бислои, их необходимо предварительно солюбилизировать (зачастую с помощью детергентов) и очистить перед кристаллизацией. А это представляет некоторые трудности по причине их нерастворимости в обычных биохимических буферах. Стандартный подход заключается в извлечении интегральных мембранных белков в растворимой форме с детергентами и проведении опытов по кристаллизации, как в случае растворимых белков. Выбор детергента и его нейтральный или ионный характер имеет решающее значение и зависит от конкретных характеристик каждого белка. Созданы специальные молекулы амфифильного полимера, называемые амфиполами, для солюбилизации мембранных белков.

Примеры кристаллизации мембранных белков.

Поскольку мембранные белки заключены в клеточные липидные бислои, их необходимо предварительно солюбилизировать и очистить перед кристаллизацией. Затем можно предпринять попытку кристаллизации посредством включения в обычные эксперименты либо гидрофобных детергентов, либо амфиполов, которые нековалентно связываются с трансмембранной поверхностью белков. Другой, весьма перспективный метод состоит в кристаллизации белка из липидных кубических фаз. Интегральный белок мембраны ограничен трехмерной сеткой изогнутых липидных бислоев, и белковые кристаллы растут в объемной кубической фазе. Интересно, что в нескольких случаях эндогенные мембранные липиды кристаллизовались совместно с белком и были обнаружены в его структуре (Navarro and Landau, 2002, Popot et al., 2003).

Еще один подход основан на использовании липидных кубических фаз для кристаллизации мембранных белков. Эти фазы формируются липидами, такими как моноолеин, при определенной температуре и гидратации. Они представляют собой водно-липидные поверхности раздела с различной кривизной. Считается, что мембранные белки диффундируют в участки меньшей кривизны, где они включаются в слоистую структуру, которая образует исключительно упорядоченные трехмерные кристаллы.

Солевые кристаллы.

Фосфат, борат и карбонат взаимодействуют с двухвалентными катионами типа Mg^2+, Zn²⁺ и Ca²⁺ для образования кристаллов. Их, как правило, легко определить, поскольку они более твердые, более крупные, зачастую двухцветные и более красивые, чем белковые кристаллы.