Технические задачи и кристаллографическая модель

Макромолекулярная кристаллография включает в себя решение ряда технических задач. Дело в том, что кристаллы биологических макромолекул дифрагируют слабо, поскольку содержат достаточное количество молекул растворителя. Необходимо определить фазы структурного фактора. Но число полезных наблюдений невелико в сравнении с количеством параметров, требуемых для построения атомной модели макромолекулы в элементарной ячейке. Однако рентгеновская структура дает богатейшую биологическую информацию, которая в полной мере оправдывает и вознаграждает затраченные усилия.

В принципе, каждый атом в элементарной ячейке определяется четырьмя параметрами, тремя пространственными координатами x, y, z его среднего положения, и температурным фактором В, который описывает подвижность атома. Белок массой 10 кДа содержит около 1000 атомов, а это означает, что необходимо определить 4000 параметров, которые необходимо определить. Однако, при определении структуры кристалла атомные координаты ограничены структурной химической информацией, например, длиной углерод-углеродной связи. На практике это уменьшает число параметров, подлежащих определению.

Структуры биологических молекул в настоящее время хранятся в базе Банка данных по белкам, (PDB, Protein Data Bank). Каждый атом модели описан посредством его положения в элементарной ячейке (координаты x, y, z), его температурного коэффициента В и степенью заполненности (от 0 до 100% в соответствии с вероятностью найти его на этом месте). Данные экспериментов и информация о качестве структуры тоже содержатся в Банке данных по белкам.

Рост кристаллов: общие принципы перехода макромолекулы из раствора в кристаллическую форму

Начальным шагом в кристаллографии является перемещение макромолекулы в раствор, в котором она будет образовывать кристаллы. Поразительно, что такие гибкие, сложные, сильно гидратированные молекулы способны располагаться упорядоченным образом. Белковый кристалл, подходящий для рентгеновской кристаллографии, содержит в среднем 10¹³–10¹⁵ отдельных молекул.

Уже первые кристаллографы понимали, что белковые кристаллы будут дифрагировать только в том случае, если они не высохшие. Это подразумевает, что "упорядоченный" белковый кристалл содержит неупорядоченный растворитель. Согласно наблюдениям, часть объема кристалла, занятая растворителем, составляет от 20 до 80%, но обычно от 40 до 60% (Bernal and Crowfoot 1934 г.).

Белковые кристаллы очень непрочные создания: при попытке проткнуть их они обнаруживают консистенцию мягкого сыра. Они удерживаются слабыми силами уровня одинарной водородной связи. Макромолекулярная кристаллизация – это процесс, зависящий от энтропии. Локальное увеличение порядка за счет организации макромолекул в кристаллической решетке уравновешивается приобретением большей свободы другими частицами в растворе. Процесс кристаллизации зависит от концентрации различных растворенных веществ и определенных физико-химических параметров, таких как рН, которые влияют на поверхностный заряд макромолекулы. Опыты по кристаллизации направлены на определение благоприятных условий для роста кристалла. В них используются следующие переменные параметры: ионное состояние, рН и концентрация так называемых осадителей, в число которых входят определенные соли, полимеры и органические растворители (Рис. E3.2).

Рис. Е3.2 Фазовая диаграмма кристаллизации белка показывает кристаллические и аморфные (некристаллические) районы фаз в зависимости от осадителя и концентраций белка

Чистота и однородность

Совершенно необходимое требование – раствор макромолекул должен быть как можно более чистым и однородным (монодисперсным). Наличие гликозилирования часто является помехой для кристаллизации, поскольку пассивный характер сахаридных цепей не способствует созданию стабильных контактов между белками, а лишь замедляет этот процесс. На практике лучше удалить или сократить группы сахаров перед проведением таких опытов либо использовать рекомбинантный белок, который не гликолизирован.

Проверка условий кристаллизации

Поскольку каждый белок ведет себя по-разному, выращивание кристаллов – процесс эмпирический и, пожалуй, творческий. Чтобы найти оптимальные условия для кристаллизации, приходится ставить многофакторные эксперименты. Как правило, в первую очередь изменяются такие физические параметры, как рН, концентрации ионов и осаждающих веществ. Существует три категории осадителей: соли (например, сульфат аммония), полимеры (например, полиэтиленгликоль) и органические растворители (например, этанол). Можно варьировать концентрацию и температуру образца (например, 37C, 20C и 4C). Процесс кристаллизации можно корректировать за счет изменения объема образца (что изменяет кинетику) или небольших концентраций добавок, таких как ионы определенных металлов, детергенты, мочевина.

Наборы для кристаллизации.

Фазовое поведение белков является существенной частью кристаллизационного процесса. Рост кристаллов из белкового раствора требует существования необычного фазового состояния, в котором белок находится между двумя термодинамическими состояниями: растворимом и преципитированном. Рост кристаллов наблюдается на границе этих двух фаз. Несколько наборов применяется для быстрой и эффективной проверки потенциальных условий кристаллизации. Например, набор, разработанный Жанкарик и Кимом, привел к облегчению поиск условий кристаллизации более, чем 500 белков, пептидов, олигонуклеотидов и небольших молекул (Jancarik and Kim, 1991 г.). Недостатком этого подхода является необходимость большого количества белка и большое количество экспериментов, необходимое для поиска условий кристаллизации того или иного белка. Эти недостатки недавно были преодолены созданием полностью автоматизированного микро устройства (5 нл реактор), позволяющего произвести тысячи экспериментов за один день при минимальном количестве реагентов. Это позволяет получить полную фазовую диаграмму белка, из которой легко получить условия для роста подходящих кристаллов. На рис. 1(а) показана фазовая диаграмма белка ксинолазы при разном соотношении татрата калия и натрия и при разной концентрации белка. Условия, в которых были получены кристаллы, отмечены черными квадратами, а преципитационные условия – красными квадратами, очерченными черным. Синие кружки относятся к условиям, в которых белок был растворим и кристаллов не образовывал. Полученные кристаллы изображены на рис. 1(б). Шкала 200 μм. (Hansen et al., 2004).

(а) (б)

После того, как белок закристаллизовался, обычно требуется получить кристаллы химически измененной или связанной лигандами формы. Проверка условий кристаллизации должна быть не формальной, а как можно более исчерпывающей, поскольку характеристики поверхности макромолекул на этом этапе могут существенно отличаться от характеристик неизмененного белка.